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Afta Epizootica - IZS Lombardia ed Emilia Romagna

FONTE: Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR)

Laboratorio Nazionale di Riferimento per l’afta epizootica
IZS Lombardia ed Emilia Romagna

Prove interlaboratorio organizzate dal LRN nel 2019

La manipolazione di virus aftosi è consentita esclusivamente nel LNR accreditato, autorizzato e annualmente controllato dall’autorità centrale per la verifica del mantenimento dei requisiti di biosicurezza specificamente previsti per i virus aftosi.
Inoltre, come in tutti gli stati membri della UE, anche in Italia l’attività diagnostica nazionale è limitata alla gestione e follow-up di rarissimi sospetti clinici e ai test sierologici richiesti per movimentazioni, import/export, esposizioni/fiere, eseguite presso il LNR. Poiché il Laboratorio èa nche assegnatario di un Laboratorio di referenza OIE/FAO per afta, l’attività diagnostica è prevalentemente indirizzata alla cooperazione/collaborazione a supporto di paesi terzi, dove la malattia è presente.
Tuttavia, il Piano di emergenza nazionale prevede che, in caso di crisi conseguente ad incursione della malattia nel paese, anche laboratori di altri IIZZSS possano essere chiamati a supportare il CERVES nell’esecuzione di alcune prove diagnostiche; in questo ambito, il LNR organizza saltuariamente Proficiency Test nazionali sulle metodiche ELISA per l’identificazione di anticorpianti-aftosi, basate sull’uso di antigeni aftosi inattivati o ricombinanti, quindi trasferibili in sicurezza anche a laboratori degli altri IIZZSS, non accreditati per la manipolazione di virus aftosi vivi, con l’obiettivo di mantenerne la formazione.


Prova interlaboratorio : RICERCA DI ANTICORPI VERSO LE PROTEINE NON STRUTTURALI (NSP) DEI VIRUS AFTOSI (DIVA TEST)

Il test permette di discriminare animali infetti con virus dell’afta epizootica da animali vaccinati. Le prove sono state eseguite utilizzando il kit pronto-uso prodotto dal LNR e distribuito ai laboratori partecipanti, unitamente al pannello di campioni da esaminare.

Matrici: N. 22 campioni di sieri bovini in cieco, rappresentativi di diverse condizioni immunologiche nei confronti dei virus dell’afta epizootica (negativi, vaccinati, infetti).

Analiti: Anticorpi specifici per la proteina non strutturale 3ABC dei virus dell’afta epizootica presenti in siero/plasma di ruminanti.

Luogo e periodo di svolgimento: Organizzazione della prova interlaboratorio (preparazione dei campioni in esame con testpreliminari e finali sugli stessi, comunicazioni e invio ai partecipanti, elaborazione dei risultati):presso il LNR. Esecuzione dei test per la prova interlaboratorio: laboratori di 10 Istituti Zooprofilattici, periodo novembre-dicembre 2019.

Numero e tipo di laboratori partecipanti: N. 10 Istituti Zooprofilattici Sperimentali, oltre al LNR che coincide con il CERVES.

Follow up e Valutazione complessiva: L’esercitazione organizzata nel 2019 ha rappresentato la prosecuzione della prova interlaboratorio condotta nel 2018: in particolare, ai laboratori è stato chiesto di esaminare lo stesso pannello di sieri, distribuito l’anno per la ricerca di anticorpi specifici per il sierotipo O e sierotipo A, con una nuova prova sierologica, pan-afta, indirizzata al rilievo di anticorpi che identificano una infezione passata o in corso (test DIVA, anticorpi verso proteine non-strutturali).

La prosecuzione dell’esercitazione 2018 ha permesso di valutare la performance dei laboratori nell’esecuzione tecnica della prova e nella corretta interpretazione dello stato immune dell’animale, sulla base dell’insieme dei risultati di tutte le prove eseguite sul medesimo siero.

Ai laboratori partecipanti è stato chiesto di esaminare i campioni in due prove indipendenti (preferibilmente da due operatori diversi). Con singole eccezioni, i valori ottenuti per i controlli di riferimento (siero di controllo positivo e debole positivo) sono risultati soddisfacentemente omogenei sia intra-prove nel medesimo laboratorio che inter-laboratori. Tutti i laboratori hanno eseguito correttamente le prove, riportando esiti conformi all’atteso per i 22 sieri in esame.

Unitamente al risultato del test, i laboratori hanno fornito l’interpretazione diagnostica sullo stato immunitario - vaccinato, infetto o naïve - dei singoli animali, sulla base delle risultanze del test DIVA e dei test sierologici per anticorpi anti-proteine strutturali specifiche del sierotipo O ed A, eseguiti nell’esercitazione 2018. Tutti i laboratori hanno attribuito il corretto “stato” agli animali, identificando correttamente 10 sieri naive, 6 sieri di animali vaccinati verso il sierotipo O o A, 6sieri da animali infetto con virus aftosi di sierotipo O o A.


Prova interlaboratorio: Proficiency Test per prove virologiche (ELISA e RT-PCR) e sierologiche (NSP-Ab ELISA) utilizzate nella diagnostica di Afta

Poiché il LNR per afta agisce anche come Laboratorio di referenza internazionale OIE/FAO, su richiesta del Laboratorio della regione turca di Cipro supportata da IAEA, il LNR ha organizzato un Proficiency Test per valutare la capacità del laboratorio di diagnosticare un focolaio di afta utilizzando per prove virologiche (ELISA e RT-PCR) e sierologiche (NSP-Ab ELISA). Per questo obiettivo sono stati preparati due pannelli di campioni come di seguito composti, unitamente al template per la trascrizione e interpretazione dei risultati.

Matrici e analiti

PANEL A: VIRUS DETECTION

Panel A for FMDV antigen and genome detection consists of non-infectious materials originated from cattle with a vesicular condition, namely N. 4 “simulated” epithelium suspensions, 2 ml each. Samples are suited to be tested by RT-PCR (any methods) and by Antigen detection and FMDV serotyping ELISA. The laboratory is expected to test these samples using relevant FMD virus-detection assays and report results. If FMDV positive samples are detected, the serotype should be defined (using an antigen detection and serotyping ELISA if available).

PANEL B: ANTIBODIES DETECTION

Panel B for FMD serological diagnosis consists of thermally inactivated bovine serum samples from cattle (n. 6 cattle sera, 0.5 ml each).
The laboratory is expected to test these samples using an FMDV-NSP-antibody ELISA and report results.
The laboratory is expected to test these samples using an FMDV-NSP-antibody ELISA and report results.

Luogo e periodo di svolgimento: Organizzazione del Proficiency Test (preparazione dei campioni, esecuzione di test preliminari e finali sugli stessi, comunicazioni e invio, elaborazione del report risultati): presso il LNR. Esecuzione dei test: Laboratorio della regione turca di Cipro. Anno 2019. 

Numero e tipo di laboratori partecipanti: Laboratorio della regione turca di Cipro.

Follow up e Valutazione complessiva

Un report ufficiale con il feedback al laboratorio rispetto ai risultati sierologici, al momento unici trasmessi, è stato predisposto ed inviato al laboratorio. I risultati del test sierologico sono stati conformi all’atteso. Non è possibile una valutazione delle capacità diagnostiche rispetto ai test virologici, pertanto alla luce dei dati sino ad ora comunicati il Laboratorio non sembra avere tutto il know-how per confermare un sospetto di afta.


PROVE INTERLABORATORIO A CUI IL LNR HA PARTECIPATO NEL 2019.

Con riferimento alla partecipazione a prove interlaboratorio per AFTA, il LNR partecipa regolarmente al Proficiency Test (PT) internazionale, organizzato annualmente dal Community Reference Laboratory per l’afta (FMD EURL), che dal 2019 ha sede presso ANSES, Francia. Nome della Prova Interlaboratorio:

Prova interlaboratorio : FMDV AND SVDV DIAGNOSTIC, PROFICIENCY TEST 2019

L’obiettivo del PT2019 europeo è stato la valutazione della capacità di ciascun laboratorio di diagnosticare focolai di Afta/MVS utilizzando prove virologiche e sierologiche implementate nei laboratori. I pannelli di campioni per le diverse prove sono stati composti sulla base di uno scenario comunicato, rispetto al quale il laboratorio doveva applicare i test diagnostici più appropriati, con interpretazione del risultato per ciascun test individualmente e nel loro insieme rispetto alla situazione simulata. In particolare, nel caso di campioni positivi è stata richiesta l’interpretazione dei dati rispetto a vaccinazione e/o infezione, e per eventuali isolati virali l’analisi di sequenza con definizione del topotipo virale e quindi della sua probabile origine. Il pannello di campioni per le prove virologiche non contemplava nel 2019 una diagnosi differenziale tra Afta e MVS, poiché lo scenario descriveva l’osservazione di lesioni vescicolari in un allevamento di soli bovini.

Matrici: 
Pannello 1: Outbreak scenarios of vesicular disease in a cattle farm N. campioni di omogenato di epitelio vescicolare da un allevamento di bovini con presenza di lesioni vescicolari (scenari simulato), per test di isolamento in colture cellulari con identificazione degli isolati, test molecolari (RT-PCR) e identificazione/caratterizzazione degli agenti identificati tramite sequenziazione del gene codificante la VP1.

Pannello 3: FMDV Serological investigation (Continuation of outbreak scenarios of Panel 1)

N. 4 sieri prelevati da 4 bovini dell’allevamento del pannello 1, da sottoporre a prove sierologiche per afta, in particolare ELISA-NSP, ELISA-SP e Sieroneutralizzazione per anticorpi tipo-specifici.

L’obiettivo è di indicare se gli animali sono infetti o vaccinati, e con quale sierotipo, scegliendo le prove diagnostiche adeguate allo scenario emerso dal pannello 1.

Analiti: Pannello 1: virus infettanti afta, genoma virale, sequenza VP1 dei virus identificati Pannello 3: anticorpi anti-NSP e anti-SP di sierotipi aftosi connessi allo scenario del pannello 1

Luogo e periodo di svolgimento: Luogo di esecuzione: presso il CERVES/LNR afta e MVS, IZSLER Brescia, Laboratori BSL3+.
Periodo di esecuzione delle prove: giugno 2019.

Numero e tipo di laboratori partecipanti: N. 37 laboratori partecipanti (inclusi 26 Stati Membri EU, 5 paesi candidati EU e 6 Paesi dei balcani supportati da EUFMD.

Follow up e Valutazione complessiva

In continuità al PT 2018, lo scopo del PT 2019 ha comportato la verifica delle performance delle varie prove diagnostiche e della capacità dei LNR di scegliere e applicare il flusso diagnostico, coerente col Piano di emergenza nazionale, utilizzando una selezione di test appropriati sulla base dell’ipotetico scenario comunicato, per una rapida conferma di focolaio.

Ai laboratori in grado di effettuare caratterizzazioni più approfondite è stata richiesta anche l’identificazione dei ceppi virali isolati dal pannello 1, utilizzando tecniche di sequenziazione genomica seguite da analisi filogenetica. Alla verifica delle prove virologiche è stata associata la verifica della capacità dei test sierologici nell’identificazione di anticorpi verso diversi sierotipi aftosi distinguendo animali infetti da animali vaccinati.

Il CERVES/LNR è tra i pochi laboratori europei in grado di dare risposta a tutte le prove del Proficiency Test. Dei 37 LNR partecipanti, solo 10 hanno le autorizzazioni e i requisiti per la manipolazione di virus vivi e tra questi solo 7, compreso il LNR italiano, hanno identificato gli agenti isolati a livello di sequenziazione.

Tutti i test diagnostici eseguiti dal LNR italiano hanno dato esiti conformi, l’interpretazione dello stato dei campioni sulla base dello scenario comunicato è stata corretta, la sequenziazione ed analisi filogenetica del ceppo di afta isolato hanno correttamente identificato il virus come appartenente al lineaggio O/EA3. Pertanto, le performance dei test eseguiti dal LNR sono ottimali.

E’ da sottolineare il numero crescente di LNR che partecipano al PT che utilizza i kit ELISA sviluppati e distribuiti dal LNR italiano.


Data di pubblicazione: 30 novembre 2020

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