RELAZIONE ANNUALE AL PNI 2019

Laboratorio Nazionale di Riferimento per il Monitoraggio delle Biotossine Marine (LNR-MB)

Fondazione Centro Ricerche Marine,  V.le A. Vespucci, 2 -  47042 Cesenatico (FC)

Nome della Prova Interlaboratorio:

1) Biotossine marine idrosolubili del tipo Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) con Metodo Chimico HPLC-FLD
AOAC OMA 2005.06
(metodo di riferimento)

Matrici: 2 campioni di omogenato di mitili (CRM/19/P/01 e CRM/19/P/02).

• CRM/19/P/01: omogenato di Mytilus galloprovincialis provenienti da diverse aree di produzione italiane, naturalmente contaminati da tossine PSP.
• CRM/19/P/02: omogenato di Mytilus galloprovincialis provenienti dalle aree di produzione della Sardegna, naturalmente  contaminati da PSP.

Analiti: Paralytic Shellfish Poisoning toxins (saxitossina, neosaxitossina, gonyautossine ed altri analoghi, espressi come saxitossina equivalente).

Luogo e periodo di svolgimento: la preparazione dei materiali di prova e l’elaborazione dei risultati pervenuti è stata eseguita presso il LNR nel periodo agosto 2019 - gennaio 2020.
L’analisi dei materiali di prova è stata effettuata presso ciascun Laboratorio Ufficiale partecipante nel periodo 1 ottobre - 15 novembre 2019

Numero e tipo di laboratori partecipanti: n°5 Laboratori Ufficiali (n°4 sezioni IZS e il LNR); inoltre un 6°  LU (Codice 1914) ha richiesto i 2 campioni per effettuare l’ottimizzazione di un metodo alternativo  (metodo chimico LC-MS/MS) per la determinazione delle tossine PSP, ma non ha poi inviato i risultati.

Follow up: tutti i 5 LU partecipanti hanno ottenuto risultati conformi, per entrambi i campioni  CRM/19/P/01 e CRM/19/P/02, identificandoli come positivi. Non è stato pertanto necessario attivare azioni di follow up.

In conclusione:

- i Laboratori Ufficiali hanno manifestato interesse per il metodo alternativo in cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS);

- per quanto riguarda il metodo chimico di riferimento AOAC 2005.06, molti LU hanno ancora la necessità di  supporto tecnico per la messa a punto del metodo.

Un primo Corso di Formazione “Workshop training sull’applicazione dell’analisi di screening e di semi-quantificazione delle tossine PSP (Metodo AOAC 2005.06)” è già stato organizzato dal LNR, presso la propria sede, in data 9 e 10 ottobre 2019. Vi ha partecipato il personale tecnico di n°9 LU.

Inoltre è stato attivato un Gruppo di lavoro al quale per il momento hanno aderito n°6 LU (IIZZSS) per l’ottimizzazione e la validazione del metodo chimico di riferimento AOAC 2005.06 e per la valutazione/applicazione del metodo alternativo in LC-MS/MS.

2) Biotossine marine idrosolubili del tipo Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) con Metodo biologico, Mouse Bioassay
AOAC OMA 959.08
(metodo alternativo)

Matrici: 2 campioni di omogenato di mitili (CRM/19/P/02 e CRM/19/P/03).

• CRM/19/P/02: omogenato di Mytilus galloprovincialis provenienti dalle aree di produzione della Sardegna, naturalmente  contaminati da PSP.
• CRM/19/P/03: omogenato di Mytilus galloprovincialis, non contaminati da tossine PSP.

Analiti: Paralytic Shellfish Poisoning toxins (espresse come saxitossina equivalente).

Luogo e periodo di svolgimento: la preparazione dei materiali di prova e l’elaborazione dei risultati pervenuti è stata eseguita presso il LNR nel periodo agosto 2019 - gennaio 2020.
L’analisi dei materiali di prova è stata effettuata presso ciascun Laboratorio Ufficiale partecipante nel periodo 1 ottobre - 15 novembre 2019.

Numero e tipo di laboratori partecipanti: n°9 Laboratori Ufficiali (n°8 sezioni IZS e il LNR);

Follow up: per entrambi i campioni (CRM/19/P/02 e CRM/19/P/03) tutti i 9 Laboratorihanno ottenuto risultati  Conformi. Non è stato pertanto necessario attivare un follow up.
 

3) Biotossine marine idrosolubili del tipo Amnesic Shellfish Poisoning (ASP) con Metodo Chimico HPLC-UV
EU-Harmonised SOP for determination of domoic acid in shellfish and finfish, Vs. 1, June 2008
(metodo di riferimento)

Matrici: 2 campioni di omogenato di molluschi bivalvi (CRM/19/A/01 e CRM/19/A/02).

• CRM/19/A/01: omogenato di Pecten sp. provenienti dalle coste atlantiche, naturalmente contaminati da tossine ASP.
• CRM/19/A/02: omogenato di Mytilus galloprovincialis provenienti dalle aree di produzione emiliano-romagnole, non contaminati.

Analiti: Amnesic Shellfish Poisoning toxins (acido domoico + epidomoico)

Luogo e periodo di svolgimento: la preparazione dei materiali di prova e l’elaborazione dei risultati pervenuti è stata eseguita presso il LNR nel periodo agosto 2019 - gennaio 2020.

L’analisi dei materiali di prova è stata effettuata presso ciascun Laboratorio Ufficiale partecipante nel periodo 1 ottobre - 15 novembre 2019.

Numero e tipo di laboratori partecipanti: n°10 Laboratori Ufficiali (9 sezioni IZS e il LNR)

Follow up: Per il campione CRM/19/A/01 n°9 LU hanno ottenuto un risultato conforme; 1 LU, (Codice 1913) ha ottenuto un risultato non soddisfacente ma non ha ancora richiesto materiale supplementare per risolvere la non conformità. Come follow up verrà effettuato un opportuno approfondimento per identificare le cause di questo risultato.

Per il campione CRM/19/A/02 tutti i 10 LU hanno restituito risultati conformi, pertanto non è necessaria alcuna azione di follow up.

4) Biotossine marine liposolubili con Metodo Chimico LC-MS/MS

EU-Harmonised SOP for detection of lipophilic marine biotoxins in molluscs, Vs. 5, January 2015 (metodo di riferimento)

Matrici: 2 campioni di omogenato di mitili (CRM/19/L/01 e CRM/19/L/02).

• CRM/19/L/01: omogenato di Mytilus edulis provenienti dalla costa atlantica, naturalmente contaminati da tossine del gruppo acido okadaico (AO).
• CRM/19/L/02: omogenato di Mytilus galloprovincialis provenienti dalle aree di produzione dell’Emilia-Romagna, naturalmente contaminati da tossine del gruppo delle yessotossine (YTXs).
   

Analiti: Tossine liposolubili (acido okadaico e derivati totali, yessotossine totali, pectenotossine totali, azaspiracidi totali).

Luogo e periodo di svolgimento: la preparazione dei materiali di prova e l’elaborazione dei risultati pervenuti è stata eseguita presso il LNR nel periodo agosto 2019 - gennaio 2020.

L’analisi dei materiali di prova è stata effettuata presso ciascun Laboratorio Ufficiale partecipante nel periodo 1 ottobre - 15 novembre 2019.

Numero e tipo di laboratori partecipanti: n°9 Laboratori Ufficiali (n° 8 sezioni IZS e il LNR) hanno applicato la Procedura Operativa Standard indicata; n°2 LU hanno partecipato alla prova impiegando uno spettrometro di massa Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap.

Follow up: per quanto riguarda il campione CRM/19/L/01 tutti i LU hanno ottenuto risultati soddisfacenti tranne il Laboratorio Codice 1903,  che ha restituito un risultato questionabile (z-score compreso tra ±3) e necessita pertanto di un ulteriore approfondimento.

Per il campione CRM/19/L/02, n°3 LU (Codice 1901, 1907 e 1913) hanno restituito risultati non soddisfacenti; n°2 LU (Codice 1908 e 1911) hanno fornito risultati questionabili; n°2 LU (Codice 1908 e 1911) non hanno rilevato alcuni analoghi del gruppo delle YTXs con cui era contaminato il campione. Si ritiene che  debba essere pianificata un’attenta indagine circa le cause dei risultati non soddisfacenti e un approfondimento  riguardo l’applicazione del metodo, i limiti di quantificazione (LOQ) e le modalità operative applicate.

Valutazione complessiva

I circuiti interlaboratorio relativi alla determinazione delle biotossine marine risultano ormai consolidati e non si riscontrano particolari criticità; tutte le prove, infatti, hanno raggiunto una valutazione complessivamente soddisfacente.

E’ tuttavia opportuno segnalare che qualche criticità permane circa l’applicazione del metodo chimico (AOAC OMA 2005.06) indicato dal Reg. (UE) 2017/1980 come nuovo metodo di riferimento per la determinazione delle biotossine marine idrosolubili del tipo Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), in sostituzione del metodo biologico (AOAC OMA 959.08)a partire dal 01/01/2019. Infatti soltanto n°6 LU (di cui n°1 LU che lo ha applicato nella sola forma di screening) hanno partecipato al circuito di intercalibrazione organizzato nel 2019, a dimostrazione che ad oggi non tutti i LU sono pronti ed adeguatamente attrezzati per l’applicazione di tale metodo.

Valutazione generale riferita alle prove interlaboratorio del quinquennio del PNI (2015-2019)

Nella propria area di competenza, ovvero il Monitoraggio delle Biotossine Marine, la Fondazione Centro Ricerche Marine di Cesenatico (LNR-MB) ha organizzato, nel periodo 2015-2019, una serie di Proficiency Test (PT), finalizzati alla valutazione delle performance dei laboratori ufficiali (LU).

Tali PT sono stati condotti annualmente e hanno compreso:

1. un circuito interlaboratorio per le PSP con il metodo biologico, MBA (Mouse BioAssay), che è stato il metodo di riferimento fino al 31/12/2018;
2. un circuito interlaboratorio per le PSP con il metodo chimico in HPLC con determinazione in FLD, il c.d. Metodo Lawrence; questo metodo è stato un metodo di determinazione alternativo a quello di riferimento fino al 31/12/2018; dal 01/01/2019 è divenuto invece il metodo di riferimento;
3. un circuito interlaboratorio per le ASP con il metodo chimico in HPLC con determinazione in UV (metodo di riferimento);
4. un circuito interlaboratorio per le tossine liposolubili con il metodo chimico in LC-MS (metodo di riferimento).

Dalla valutazione delle performance dei LU partecipanti è possibile rilevare che:

1. Esercizio di intercalibrazione per la determinazione delle tossine idrosolubili del tipo Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), eseguita con il metodo biologico, Mouse BioAssay (AOAC OMA 959.08).

Tutti i LU sono in grado di distinguere fra campioni contaminati e non contaminati. Tuttavia, è opportuno menzionare che, poiché nessuno dei LU esegue la standardizzazione del saggio biologico[1] richiesta dal metodo per la quantificazione delle tossine PSP, il risultato ottenuto è soltanto qualitativo: “tossina determinabile” o “tossina non determinabile”. In caso di “tossina determinabile” (campione positivo) la quantificazione delle biotossine idrosolubili del tipo Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) deve essere effettuata dal NRL-MB, secondo quanto deliberato dal Ministero della Salute DGSAN, con Nota  14939-P-I1CON/1 dell’11/04/2006.

2. Esercizio di intercalibrazione per la determinazione delle tossine idrosolubili del tipo Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), eseguita con il metodo chimico HPLC-FLD (AOAC OMA 2005.06).

Questo metodo ha sostituito il MBA in qualità di metodo di riferimento dal 01/01/2019. Si tratta di una metodica piuttosto complessa che i LU hanno avuto difficoltà ad implementare. Il numero di partecipanti a questo PT è sempre molto contenuto: 3 LU nel 2015, 2 nel 2016, 2007 e 2018. L’EURLMB di Vigo ha implementato una Procedura Operativa Standard di questa metodica, semplificando l’approccio in modalità di screening. Nel 2019, supportati dall’EURLMB, il LNR-MB italiano ha avviato una attività di training per i LU e in questo anno sono stati 5 i LU che hanno partecipato a questo circuito, tutti con risultato soddisfacente. Allo stato attuale solo 2 LU italiani hanno accreditato il metodo di riferimento ma altri hanno già attivato la procedura.

Continuerà anche per il 2020 un adeguato supporto tecnico ai LU che ne facciano richiesta.

3. Esercizio di intercalibrazione per la determinazione delle tossine Amnesic Shellfish Poisoning (ASP) con metodo chimico HPLC-UV (EU-Harmonised SOP, vs.1, June 2008).

Si tratta di una metodica ormai consolidata che nella stragrande maggioranza dei casi non presenta più criticità.

4. Esercizio per la determinazione delle tossine liposolubili con il metodo chimico LC-MS/MS (EU-Harmonized SOP, vs. 5 january 2015).

Questa metodica ha sostituito il MBA in qualità di metodo di riferimento dal 1° luglio 2011 (Reg. UE 15/2011). Nella maggioranza dei casi i PT condotti per questa prova hanno restituito un risultato soddisfacente, pur permanendo ancora qualche criticità per altri.

In tutti i casi di risultati non conformi, il LNR-MB ha messo in atto un’attenta indagine circa le cause e si è reso disponibile sia all’invio di materiale supplementare per la ripetizione delle prove che per attività di formazione e supporto tecnico.