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Escherichia coli - ISS

FONTE: Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR)

LNR per Escherichia coli
ISS

Matrice: ceppi di E. coli patogeni

Analita: Geni di virulenza e di sierogruppo

Luogo e periodo di svolgimento: Novembre 2018-Febbraio 2019

Numero e tipo di laboratori partecipanti: Nove Laboratori (otto di sette Istituti Zooprofilattici e uno da un’Agenzia di Tutela della Salute)

Follow up: Analisi comparativa dei risultati e offerta di training e assistenza per il problem solving individuale (Report finale pubblicato al seguente link: http://old.iss.it/binary/coli/cont/Report_PT23_ITA.pdf)

Valutazione complessiva

Lo studio consisteva nell’identificazione dei diversi gruppi di E. coli patogeni attraverso l’identificazione dei geni di virulenza e la loro caratterizzazione relativamente al sierogruppo (ceppi STEC) e al sottotipo dei geni codificanti le Shiga tossine.

La caratterizzazione del sierogruppo dei ceppi è stata richiesta limitatamente ad un pannello di 13 sierogruppi di E. coli selezionati per la loro rilevanza epidemiologica.

Valutazione dei risultati:

Il PT23 aveva come obiettivo di valutare la capacità dei laboratori del controllo ufficiale degli alimenti di riconoscere e caratterizzare i ceppi patogeni di E. coli, che possono causare malattie nell’uomo in seguito all’ingestione di alimenti contaminati.

L’analisi dei risultati dello studio inter-laboratorio ha messo in evidenza che la maggior parte dei laboratori partecipanti era in grado di identificare correttamente i geni di virulenza dei ceppi di Escherichia coli patogeni e i principali sierogruppi dei ceppi STEC. Lo studio ha inoltre messo in luce spazi di intervento per migliorare la capacità di rilevazione dei diversi sottotipi dei geni codificanti le Shiga tossine che rappresenta il nuovo paradigma per la valutazione del rischio associato con le infezioni da STEC, come definito dalla recente opinione EFSA “Pathogenicity assessment of Shiga toxin‐producing Escherichia coli (STEC) and the public health risk posed by contamination of food with STEC” (DOI:10.2903/j.efsa.2020.5967).


Matrice: Farina

Analita: ceppi STEC

Luogo e periodo di svolgimento: Ottobre 2019-Novembre 2019

Numero e tipo di laboratori partecipanti 25 Laboratori da 10 Istituti Zooprofilattici Sperimentali (IIZZSS), l’ARPA di Roma e quella del Friuli-Venezia Giulia, i Laboratori di Prevenzione di due Agenzie di Tutela della Salute (ATS), rispettivamente della Brianza e di Milano, e la USL di Firenze. 

Follow up: Analisi comparativa dei risultati e offerta di training e assistenza per il problem solving individuale (Report finale inviato ai laboratori partecipanti per E-mail a causa dell’impossibilità di caricare i contenuti sul sito web conseguente alle misure di lavoro agile domiciliato previste dai DPCM riguardanti l’emergenza COVID-19)

Valutazione complessiva

Lo studio era bassato sulla capacità di rilevare la presenza di ceppi STEC nella farina. Recentemente, la farina è stata identificata come un veicolo per l’infezione da STEC nel corso di epidemie trans-nazionali. Pertanto, si è deciso di organizzare questo studio inter-laboratorio, con lo scopo di migliorare la preparazione dei laboratori del controllo ufficiali nel testare la presenza degli STEC nella farina applicando il metodo standard ISO TS 13136:2012.

Valutazione dei risultati

Il PT25 aveva come obiettivo di valutare la capacità dei laboratori del controllo ufficiale degli alimenti di identificare la presenza di un ceppo STEC appartenente al sierogruppo O121 nella farina, una matrice recentemente identificata come veicolo di infezione da STEC. Il set analitico era costituito da tre campioni di 25 grammi di farina contaminati con diversi livelli del ceppo STEC. In particolare, un campione era negativo, uno contaminato con una quantità di batterio leggermente al di sotto della LOD50 determinata dal laboratorio di riferimento Europeo per E. coli nel corso di analogo proficiency test, e uno con una quantità 5 volte superiore. I risultati hanno mostrato una buona preparazione del network dei laboratori ufficiali italiani. Infatti, il campione negativo è stato riconosciuto come tale dal 90% dei laboratori. I tre laboratori che hanno identificato contaminazioni di questo campione saranno oggetto di follow-up da parte del LNR che contatterà i responsabili per verificare la fonte della contaminazione e offrirà possibilità di training seguito dall’ invio di campioni di backup per la verifica dell’efficacia. Per quanto riguarda i campioni positivi, quello a bassa carica è stato trovato positivo dal 44% dei laboratori. Questo dato, apparentemente negativo, è in realtà in linea con il risultato atteso dal momento che la quantità di ceppo contaminante era prossima, e anzi leggermente al di sotto, della LOD50, valore che rappresenta il livello di contaminazione a cui approssimativamente corrisponde un valore positivo per il 50% dei laboratori. Il campione con la carica più alta è stato trovato positivo dal 96% dei laboratori. Infine, per quanto riguarda l’isolamento, tutti i laboratori che avevano identificato il campione a bassa carica come positivo sono anche riusciti ad isolare il ceppo contaminante. Analogamente, tutti i laboratori hanno isolato il ceppo STEC dal campione con alta carica con l’eccezione di tre laboratori che non hanno riportato questa informazione.

Due laboratori hanno ottenuto un numero di penalità superiore a otto, che rappresenta la soglia della prestazione soddisfacente. Questi laboratori saranno contattati dal LNR per E. coli e saranno valutate le opzioni di follow up per la risoluzione.


Matrice: Ceppi isolati di E. coli patogeni

Analita: Geni di virulenza STEC e di sierogruppo

Luogo e periodo di svolgimento: Ottobre-Dicembre 2019

Numero e tipo di laboratori partecipanti: Nove Laboratori (da sei Istituti Zooprofilattici)

Follow up: Analisi comparativa dei risultati e offerta di training e assistenza per il problem solving individuale (Report finale in fase di redazione. Report finale sarà inviato ai laboratori partecipanti per E-mail a causa dell’impossibilità di caricare i contenuti sul sito web conseguente alle misure di lavoro agile domiciliato previste dai DPCM riguardanti l’emergenza COVID-19)

Valutazione complessiva

Lo studio consisteva nell’identificazione dei geni di virulenza di ceppi di E. coli produttori di Shiga tossine e nella caratterizzazione del sierogruppo di appartenenza. Inoltre, ai laboratori è stato chiesto di effettuare un’analisi delle relazioni filogenetiche tra gli isolati con lo scopo di valutare la capacità di identificare clusters di ceppi al fine di iniziare l’analisi epidemiologica di possibili focolai epidemici e di identificare le sorgenti di infezione.

La scelta di questa particolare matrice si basava sulle seguenti considerazioni:

  • I ceppi di E. coli produttori di Shiga tossine sono in grado di causare gravi malattie nell’uomo
  • Sono tutti indistinguibili fenotipicamente dai ceppi di E. coli commensali
  • Presentano un’elevata variabilità genetica anche all’interno dei singoli sierogruppi
  • È importante che i laboratori siano in grado di identificare i ceppi STEC per garantire la salubrità degli alimenti e di valutarne la correlazione filogenetica per fornire supporto alle indagini epidemiologiche sui focolai di infezione

Valutazione dei risultati:

Due dei nove laboratori partecipanti non hanno riportato risultati attraverso la piattaforma di raccolta on line. Dei rimanenti sette, tutti sono stati in grado di identificare correttamente i sette ceppi inviati come STEC. Un solo laboratorio ha riportato un errore relativo alla mancata identificazione del gene stx2 in uno dei ceppi inviati.

Per quanto riguarda la sezione facoltativa del PT26 relativa alla caratterizzazione molecolare, solo tre laboratori hanno partecipato, due dei quali hanno utilizzato la metodica di PFGE e due il sequenziamento dell’intero genoma (WGS). Uno dei tre laboratori ha inviato i risultati utilizzando entrambe le metodiche. L’analisi dei risultati, sebbene condotta su pochi dati ha mostrato chiaramente che l’utilizzo del WGS ha consentito di individuare correttamente i due ceppi correlati, mentre nessuno dei due laboratori che hanno utilizzato la PFGE ha identificato il cluster formato dai due isolati.

Nel complesso, i risultati dello studio indicano che in Italia esiste un’eccellente capacità di identificare correttamente i ceppi STEC. Inoltre, si è evidenziato come il WGS sia da preferire per gli scopi di caratterizzazione molecolare degli isolati STEC, rispetto all’utilizzo di metodiche come la PFGE.


Valutazione dei PT eseguiti negli ultimi 5 anni

Nel periodo in esame, sono stati somministrati al network dei laboratori coinvolti nel controllo ufficiale degli alimenti 13 sessioni di proficiency testing (PT). In particolare, sette di queste erano basate sulla identificazione di ceppi STEC in matrici alimentari (germogli, carne macinata bovina, acqua di germogliazione, rucola, farina). La scelta delle matrici era basata sulla disponibilità di regolamenti con criteri microbiologici o sulla rilevanza epidemiologica legata al coinvolgimento dei prodotti alimentari in focolai epidemici. I rimanenti sei PT erano centrati sulla capacità dei laboratori di identificare e/o caratterizzare a livello molecolare ceppi di Escherichia coli appartenenti ai diversi gruppi patogeni.

La partecipazione ai PT organizzati dal LNR per E. coli nel quinquennio in esame ha visto un trend crescente per quanto riguarda i PT organizzati su matrice, passando dai 10 laboratori (da nove IIZZSS e da una ASL) che hanno partecipato al PT15 (2015) ai 25 laboratori (da 10 IIZZSS, due ARPA, due ATS e una USL) che hanno partecipato al PT25 (2019). Per quanto riguarda i PT centrati sulla identificazione e tipizzazione molecolare dei ceppi isolati di E. coli patogeni una media di sette laboratori ha partecipato ai vari PT con l’eccezione del PT18 (2016) al quale hanno partecipato 14 laboratori.

La metodologia analitica per l’esame delle matrici alimentari per la presenza di STEC utilizzata nei differenti PT era quella prevista dal metodo standard ISO TS 13136:2012, il metodo raccomandato per l’identificazione di questo patogeno. Il metodo prevede una fase di screening seguita dal tentativo di isolamento. Le performance dei laboratori partecipanti erano generalmente soddisfacenti per quanto riguarda la fase di screening con la quasi totalità dei laboratori in grado di identificare correttamente le matrici positive per la presenza di STEC. Una buona performance è stata anche rilevata per la fase di isolamento con una media del 75% dei laboratori in grado di isolare il microrganismo in purezza. Bisogna sottolineare che il metodo presenta una criticità intrinseca importante per quanto riguarda l’isolamento. Infatti, non essendo disponibili terreni selettivi e/o differenziali per la crescita di ceppi STEC e per la loro differenziazione dai ceppi di E. coli commensali, questa condizione rappresenta il principale ostacolo al buon esito della fase di isolamento ed è generalmente considerata dalla comunità scientifica uno spazio di miglioramento della metodologia che è al momento in fase di revisione. Inoltre, la matrice acqua di germogliazione, ancorché prevista dal regolamento 209/2013 come una matrice da analizzare per la presenza di STEC, non dispone di una modalità di trattamento per l’introduzione nel flusso del metodo ISO TS 13136 se non quella sviluppata dal laboratorio europeo di riferimento che si trova attualmente in fase sperimentale di valutazione.

Per quanto concerne la caratterizzazione degli isolati, il numero dei laboratori partecipanti rappresenta senz’altro uno spazio di miglioramento, essendo questa attività cruciale per la valutazione del rischio e fortemente raccomandata da EFSA come un’attività prioritaria per i ceppi STEC.

I laboratori partecipanti hanno mostrato un’ottima capacità di identificare correttamente i ceppi STEC con spazi di miglioramento per l’identificazione degli altri tipi di E. coli patogeni. Per la tipizzazione, i laboratori che eseguono la PFGE hanno evidenziato difficoltà nel produrre profili compatibili con quelli di riferimento mettendo in evidenza le difficoltà intrinseche della metodologia, peraltro già note. È importante sottolineare che dal PT23 (2019) è stato introdotto l’utilizzo del sequenziamento dell’intero genoma (WGS) nel profilo dei PT organizzati dal LNR per E. coli. Nonostante i pochi laboratori partecipanti che hanno adottato questa metodica è risultato evidente che il passaggio al WGS rappresenta un’alternativa credibile alla PFGE con una performance nettamente superiore e passibile di standardizzazione.

In conclusione, gli spazi di miglioramento identificati nel corso di questa valutazione saranno utilizzati dal LNR per E. coli per mettere a punto le attività riguardanti l’offerta di formazione attraverso stage da effettuare in laboratorio oltre a mantenere l’attività di supporto e valutazione dei percorsi analitici adottai dai diversi laboratori del controllo ufficiale su richiesta.

Inoltre, occorrerà comunque procedere alla sensibilizzazione dei laboratori verso l’attività di tipizzazione molecolare e verso il passaggio al WGS al fine di aumentare la base di laboratori che eseguono questa attività, anche per rispondere al debito informativo con l’Europa, e che dovranno essere mantenuti sotto controllo esterno di qualità.


Data di pubblicazione: 30 novembre 2020

Tag associati a questa pagina: Sicurezza alimentareZoonosi


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