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Tubercolosi Bovina - IZS Lombardia ed Emilia Romagna

FONTE: Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR)

LNR per la tubercolosi bovina
IZS Lombardia ed Emilia Romagna

Circuito Interlaboratorio per:

1) Isolamento di Mycobacterium bovis con terreni liquidi e/o solidi da campioni di linfonodo/organo (omogenato di tessuto).

2) Rilevamento del gruppo Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) mediante PCR Real Time da campioni di linfonodo/organo (omogenato di tessuto).

1. INTRODUZIONE

L’obiettivo generale dei circuiti è fornire ai partecipanti informazioni sullo standard di qualità di esecuzione della prova nell’ottica di un miglioramento continuo delle proprie prestazioni. In particolare ciò avviene attraverso la valutazione della capacità di:

  • Valutare l’efficienza ed il mantenimento della metodica PCR per la ricerca presuntiva di M. bovis
  • Valutare l’efficienza ed il mantenimento del test colturale per la ricerca presuntiva di M. bovis.

Matrici

Pannello di n° 4 campioni così costituiti:

N° 1 campione di omogenato (CTR1) positivo di campo ottenuto da linfonodo risultato positivo a M. bovis  identificato e genotipizzato.

  • N° 3 campioni omogenati di organo negativo (CTR2, CTR3, CTR4).
  • N° 4 microprovette da unire ad ogni omogenato contenenti rispettivamente una soluzione di 100 µl di M. bovis BCG a titolo noto (CTR2), una soluzione di 100 µl di M. fortuitum (CTR3) a titolo noto e due microprovette con 100 µl di soluzione PBS (CTR1-CTR4).

Tabella 1: Identificazione dei campioni
Tabella 1

Analiti

Per le prove batteriologiche e molecolari:

  • Micobatteri
  • Genoma dei micobatteri, mediante PCR Real Time.

Luogo e periodo di svolgimento

Luogo: Italia, dieci laboratori (vedi dettaglio punto successivo)

Periodo: Marzo 2016- Febbraio 2017

Numero e tipo di laboratori partecipanti

1.2 Partecipanti

I laboratori degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali che hanno aderito al circuito sono stati:

  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno (Catanzaro)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno (Portici)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise (Campobasso)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta (Torino)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna (Sassari)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia (Barcellona P/G)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia (Catania)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia (Palermo)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche (Perugia)

Anche l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia – Romagna, che ha organizzato il circuito, vi ha anche preso parte in qualità di partecipante.

Follow up, Conclusioni e Raccomandazioni

Tutti i laboratori hanno riconosciuto correttamente i campioni positivi grazie alla lettura in parallelo dei terreni solidi. In 4 casi  l’utilizzo di un solo terreno avrebbe portato ad errori (tabella 2) nell’identificazione del campione 1 (M bovis).

Tabella 2: Dettaglio dell’esito delle prove per ogni singolo campione
Tabella 2

Questo dato conferma la necessità di utilizzare la coppia dei terreni per l’identificazione di M bovis. Per quanto riguarda il campione negativo tutti i laboratori lo hanno identificato correttamente, tranne due che hanno avuto problemi di inquinamento dei terreni in entrambe le piastre.

Per quanto riguarda la riproducibilità, il grado di accordo, l’analisi della tabella 3 mostra come quasi la totalità dei laboratori abbia mostrato una concordanza pari ad 1 rispetto al risultato atteso in ogni laboratorio.

Tabella 3: valori di Kappa tra laboratori calcolato sui 4 campioni di riferimento
Tabella 3

I due laboratori che hanno mostrato valori diversi sono il laboratorio 64 ed il laboratorio 100 che hanno avuto problemi di inquinamento di terreni.

La concordanza tra tutti i laboratori rispetto all’atteso è risultata molto alta; difatti il valore di K pari a 0.875 secondo la tabella proposta da Landis & Koch, è interpretabile come accordo quasi perfetto. La concordanza tra tutti i laboratori, calcolata secondo il metodo proposto da Quatto è risultata 0.82, tale metodo misura il grado di concordanza tra diversi laboratori, indipendentemente dal risultato atteso. Tutti i valori ottenuti sono interpretabili come un alto grado di riproducibilità.

Per quanto riguarda la PCR i laboratori che hanno partecipato al circuito sono 4, tutti i laboratori hanno correttamente riconosciuto i campioni negativi. I due campioni positivi sono stati riconosciuti correttamente da 3 laboratori, mentre il quarto laboratorio pur avendo evidenziato la presenza di deboli bande ha dato esito negativo.

La concordanza tra tutti i laboratori rispetto all’atteso è risultata molto alta; difatti il valore di K pari a 0.875 secondo la tabella proposta da Landis & Koch, interpretabile come accordo quasi perfetto, indica una elevata riproducibilità.

Dall’analisi qualitativa è stato possibile saggiare una effettiva e soddisfacente concordanza tra i diversi laboratori nell’identificare correttamente i campioni, come esplicitato dalla Kappa di Cohen.

Lo scopo del circuito è quello di verificare i livelli di competenza tecnica dei laboratori che eseguono l’esame colturale  per la ricerca di M. bovis. Complessivamente la prova valutativa ha mostrato un risultato soddisfacente e piuttosto omogeneo tra i partecipanti. Tutti i laboratori sono in grado di isolare M. bovis con buona efficienza.


Riferimenti

  • Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals , ed 2009, cap 2.4.6, par B.1.2 “Bovine tuberculosis - Diagnostic Techniques - Identification of the agent - Culture of Mycobacterium bovis
  • FLEISS J.L. (1981). Statistical methods for rates and proportions. John Wiley & Sons, New York, USA
  • P. Quatto (2004). “Un test di concordanza tra più esaminatori”. In: Statistica, vol. 64, n. 1, pp. 145-151
  • P. Quatto (2004). “Un test sulla natura casuale dell’accordo tra più esaminatori”. In: Statistica Applicata, vol. 16, n. 3, pp. 375-384.
  • J. Richard Landis e Gary G. Koch del 1977 “The measurement of observer agreement for categorial data” Biometrics, Vol. 33, pp.159-174.


Prove interlaboratorio organizzate

Circuito Interlaboratorio PCR identificazione micobatteri

Descrizione

Il Centro di Referenza per La TB ha distribuito i metodi d’identificazione molecolare dei micobatteri agli IIZZSS che comprendono:

  • Identificazione del genere Mycobacteium, del gruppo Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) e di M. avium mediante le reazioni PCR descritte da Kulski et al. (1995);
  • Differenziazione dei micobatteri del gruppo MTBC (M. bovis, M. caprae, M. microti, M. tuberculosis/M. canettii, M. africanum) mediante identificazione dei polimorfismi del gene gyrb.

Obiettivo

  • Verificare l’efficienza e il mantenimento dei metodi d’identificazione descritti da Kulski et al. (1995) o eventuali metodi alternativi;
  • Verificare l’efficienza e il mantenimento del metodo PCR/RFLP del gene gyrb o di eventuali metodi alternativi per l’identificazione delle specie del gruppo MtbC.

Matrici

Pannello di n° 10 campioni costituiti da DNA estratto da colture di ceppi batterici mediante trattamento termico a 95°C per 15 min. (vedi Tabella 2). I campioni di DNA sono identificati con un codice numerico.

Tabella 4: Identificazione dei campioni
Tabella 4
NA: non applicabile

Analiti

Per le prove molecolari:

  • Genoma dei micobatteri mediante PCR end point.

Luogo e periodo di svolgimento

Luogo: Italia, nove laboratori (vedi dettaglio punto successivo)

Periodo: Dicembre 2017- Marzo 2018

Numero e tipo di laboratori partecipanti

I laboratori degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali che hanno aderito al circuito sono stati:

  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno (Catanzaro)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno (Portici)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise (Teramo)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta (Torino)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna (Sassari)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia (Barcellona P/G)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche (Perugia)
  • Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e della Toscana (Roma)

Anche l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia – Romagna, che ha organizzato il circuito, vi ha anche preso parte in qualità di partecipante.

Follow up, Conclusioni e Raccomandazioni

Il circuito si è appena concluso, i dati sono in corso di elaborazione.


Nella presente relazione è descritta l’attività del LNR-TB sia come organizzatore di circuiti interlaboratorio che come partecipante.

Il LNR-TB organizza ogni anno un circuito interlaboratorio per la rete nazionale degli Istituti Zooprofilattici (IIZZSS). In particolare nel 2016 ha organizzato un test per l’isolamento di M. bovis utilizzando terreni solidi e/o liquidi e il rilevamento del gruppo MTBC mediante PCR Real Time. Poiché il report finale è stato inviato nel 2017, il circuito è stato inserito nella relazione al PNI per il 2017. La prova valutativa per l’isolamento ha mostrato risultati soddisfacenti e piuttosto omogenei tra i partecipanti, mentre la prova PCR esiti molto soddisfacenti e un’elevata riproducibilità.

Nel 2017 è stato organizzato un circuito per l’identificazione di micobatteri da ceppo isolato mediante metodi molecolari (PCR end point) che si è appena concluso, pertanto l’elaborazione dei dati e il report finale non sono ancora disponibili.

Il LNR ha partecipato a numerosi circuiti interlaboratorio organizzati dall’EURL-TB (verifica dei metodi di isolamento di micobatteri, rilevamento di MTBC mediante PCR Real Time, diagnosi di tubercolosi bovina prova g-interferon) e da altre organizzazioni internazionali quali:

  • INSTAND: valutazione dei metodi per l’identificazione molecolare e microbiologia/biochimica dei ceppi isolati di micobatteri,
  • QCMD: valutazione del metodo per la ricerca di MTBC mediante PCR Real Time.
  • AHLVA: valutazione del Metodo per la diagnosi di tubercolosi bovina prova g-interferon.

Gli esiti dei circuiti interlaboratorio organizzati dal l’EURL-TB verranno comunicati nel 2018. Quelli organizzati nel 2016 con esiti disponibili nel 2017, hanno mostrato per il nostro laboratorio risultati più che soddisfacenti.

Per quanto riguarda i risultati degli altri circuiti (INSTAND, QCMD, AHLVA), il LNR-TB ha ottenuto esiti conformi in tutte le prove mostrando ottime performance per i metodi in esame. Queste valutazioni positive garantiscono lo standard di qualità di esecuzione dei metodi ufficiali utilizzati presso il LNR-TB per la diagnosi di TB.


Data di pubblicazione: 30 giugno 2018

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