RELAZIONE ANNUALE AL PNI 2017

LNR PER L’AFTA EPIZOOTICA e per la MALATTIA VESCICOLARE DEL SUINO
IZS Lombardia ed Emilia Romagna (IZSLER), Brescia

Introduzione

La manipolazione di virus aftosi e del virus della Malattia Vescicolare del Suino (MVS) è consentita esclusivamente nel LNR accreditato, autorizzato e controllato dall’autorità centrale per la verifica del mantenimento dei requisiti di biosicurezza specificamente previsti per i virus aftosi (ref. “Minimum Biorisk Management Standards for laboratories working with FMDV in vitro/in vivo” -2013, approvato dalla EuFMD Commission).

Test diagnostici per Afta Epizootica
Come in tutti gli stati membri della UE, anche in Italia la sorveglianza nei confronti dell’afta epizootica è basata sulla segnalazione e follow-up di forme cliniche sospette. Non essendo in atto un programma di monitoraggio attivo fondato su prove diagnostiche, l’attività diagnostica nazionale è limitata alla gestione di rarissimi sospetti clinici e ai test sierologici richiesti per movimentazioni, import/export, esposizioni/fiere, eseguiti presso il LNR. Poichè il Laboratorio è anche assegnatario di un Laboratorio di referenza OIE/FAO per afta, l’attività diagnostica è prevalentemente indirizzata alla cooperazione/collaborazione a supporto di paesi endemici.

Con riferimento alla partecipazione/organizzazione di prove interlaboratorio per afta, il LNR partecipa regolarmente al Proficiency Test (PT) internazionale, organizzato annualmente dal Community Reference Laboratory/World Reference Laboratory (vedi dettaglio report più avanti), ha saltuariamente organizzato e gestito in anni precedenti, nell’ambito di progetti twinning o su richiesta di EUFMD/FAO, PT per svariate prove diagnostiche sia virologiche che sierologiche a livello internazionale, ha organizzato alcuni Proficiency Test nazionali sulle metodiche ELISA per l’identificazione di anticorpi anti-aftosi, basate sull’uso di antigeni aftosi inattivati o ricombinanti, quindi trasferibili in sicurezza anche a laboratori regionali italiani non accreditati per la manipolazione di virus aftosi vivi.

In considerazione dell’assenza di una attività diagnostica regolare nel paese e date le adeguate performance già dimostrate dai laboratori regionali italiani nell’utilizzo di kit pronto-uso prodotti dal LNR, si è ritenuto non necessario ripetere il suddetto esercizio con frequenza annuale. Per verificare il mantenimento delle performance nell’ottenimento ed interpretazione di risultati conformi da parte dei laboratori regionali che potrebbero essere chiamati a supportare il CERVES in caso di emergenza, è pianificata nell’arco del 2018, dopo una sospensione di due anni, l’organizzazione di un PT per prove sierologiche per afta epizootica.

Test diagnostici per MVS
Dal 1995 è in atto in Italia un Piano Nazionale di sorveglianza ed eradicazione della Malattia Vescicolare del Suino. Mentre i test virologici e le prove di conferma che richiedono l’utilizzo di virus vivo sono eseguiti esclusivamente dal LNR, le analisi sierologiche previste dal Piano sono svolte presso gli Istituti Zooprofilattici Sperimentali (IZS) territorialmente competenti, utilizzando il test di riferimento OIE (reazione ELISA competitiva basata sull’anticorpo monoclonale 5B7), sviluppato dal Centro di Referenza nazionale per le Malattie Vescicolari (CERVES). I reagenti calibrati per l’esecuzione del test, basato su antigene inattivato, sono prodotti e distribuiti dal LNR/CERVES.

Il LNR organizza con cadenza annuale o ad anni alterni un Proficiency Test (PT) con l’obiettivo di verificare il mantenimento delle performance degli 11 laboratori IZS coinvolti nell’esecuzione del test ELISA di screening ufficiale.

Nome della Prova Interlaboratorio:

Foot-and-Mouth Disease and Swine Vesicular Disease – Proficiency Testing Scheme (PTS) 2017

Premessa

Ogni anno il CERVES/LNR per afta partecipa al proficiency test (PT) internazionale, organizzato dal Community Reference Laboratory/World Reference Laboratory.

I PT annuali sono organizzati congiuntamente per AFTA e MVS, comportano l’analisi di campioni, differenziati in quattro pannelli con diversi scopi diagnostici (per prove virologiche con materiali infettanti e non, e prove sierologiche per entrambi i patogeni), e richiedono una diagnosi differenziale con interpretazione finale sul risultato per ciascun test individualmente e nel loro insieme. Quindi, questa tipologia di proficiency tests verifica sia le performance del laboratorio relativamente a singoli test utilizzati, sia la capacità di interpretare correttamente i risultati ottenuti nella complessità delle situazioni simulate (diagnosi differenziale e nel caso di afta vaccinazione e/o infezione con quale sierotipo).

I campioni per il PTS 2017 sono pervenuti al CERVES alla fine di ottobre, con richiesta di produrre i risultati entro febbraio 2018, pertanto come di consueto l’esito del PT sarà comunicato durante il 2018.

Matrici

Pannello 1: Outbreak scenarios of vesicular diseases (including FMD and SVD)

N. 6 campioni di omogenato di epitelio vescicolare suino da tre diversi allevamenti (1a, 1b, 1c) con presenza di lesioni vescicolari (scenario simulato), per test di isolamento in colture cellulari, test molecolari e caratterizzazione tramite sequenziazione

Pannello 2: Quality Assurance, FMDV samples, per verificare la capacità di riconoscere i ceppi virali più recenti che possono minacciare l’UE ed altre regioni.

N. 4 campioni bovini, simulazione di omogenato di epitelio vescicolare, negativi o contaminati con virus aftosi di vario sierotipo, per test ELISA e PCR finalizzati alla dimostrazione di antigeni e genoma virali di virus aftosi.

Pannello 3: Serological samples outbreak scenarios for vesicular diseases.

N. 3 sieri bovini per prove sierologiche afta (ELISA-SP, ELISA-NSP, Sieroneutralizzazione, vari sierotipi), correlati allo scenario del pannello 1a e 1b.

N. 3 sieri bovini per prove sierologiche afta (ELISA-SP, ELISA-NSP, Sieroneutralizzazione, vari sierotipi), da un’area endemica con vaccinazione.

Pannello 4: Serological samples after outbreak scenario of panel 1c has been contained.

N. 3 sieri suini per prove sierologiche MVS (ELISA screening, ELISA IgG/IgM, Sieroneutralizzazione).

Analiti

Pannello 1: virus infettanti afta e MVS (ed eventualmente genoma virale), sequenza VP1 virus aftosi

Pannello 2: antigeni e genoma virus aftosi e MVS

Pannello 3: anticorpi anti-SP e anti-NSP dei virus aftosi

Pannello 4: anticorpi anti-MVS

Luogo e periodo di svolgimento

Luogo: presso il CERVES/LNR afta e MVS, IZSLER Brescia, Laboratori BSL3+.

Periodo di esecuzione delle prove: Novembre 2017.

Numero e tipo di laboratori partecipanti

Laboratori Nazionali di referenza di tutti gli stati membri EU, oltre a numerosi Laboratori Nazionali di referenza di Paesi extra-CEE.

Valutazione complessiva

Nel 2017, per il secondo anno, ai laboratori in grado di effettuare caratterizzazioni più approfondite è stata richiesta anche l’identificazione dei ceppi virali di afta isolati dal pannello 1, utilizzando tecniche di sequenziazione genomica seguite da analisi filogenetica.

Inoltre, lo scopo del PTS è stato esteso, oltre che alla abituale verifica delle performance delle varie prove diagnostiche finalizzata al mantenimento dei requisiti di Qualità, anche alla verifica dei rispettivi Piani di emergenza: ai laboratori è stato chiesto di descrivere il flusso diagnostico, utilizzare una selezione di test appropriati per la rapida conferma di focolaio di Afta/MVS e per una sorveglianza post-focolaio, e interpretare i risultati sulla base degli ipotetici scenari comunicati.

Il CERVES/LNR è sempre stato tra i pochi laboratori europei in grado di dare risposta a tutte le prove del ring test ottenendo esiti conformi sia nella produzione del dato analitico che nell’interpretazione, con sensibilità adeguata, in tutte le prove.

È consuetudine degli organizzatori del PTS comunicare gli esiti l’anno successivo a quello di esecuzione delle prove. Pertanto, gli esiti del PTS 2017 saranno resi disponibili nel 2018 (mese di maggio). Questa modalità organizzativa non consente di commentare le risultanze del ring test eseguito nell’anno, mentre è sono commentati nelle successive NOTE 1) e 2) i risultati del PTS dell’anno precedente.

NOTA 1): Nel 2017 il WRL/EURL ha comunicato i risultati del PTS/2016: tutte le svariate prove hanno dato esiti conformi, l’interpretazione dello stato dei campioni sulla base degli scenari definiti è stata corretta, la sequenziazione ed analisi filogenetica del ceppo di afta isolato hanno correttamente identificato il virus come appartenente al lineaggio A/G-VII. Solo12 di 27 laboratori nazionali in EU hanno fornito questo approfondimento e solo 11 laboratori sono in grado di effettuare i test di isolamento virale, avendo laboratori autorizzati a manipolare virus aftosi.

NOTA 2): Il report conclusivo del PTS-2016, agli atti presso il LNR, riporta i risultati ottenuti con i kit ELISA prodotti e distribuiti dal LNR-CERVES per tipizzazione di antigeni e anticorpi aftosi utilizzati da alcuni laboratori partecipanti. Dai risultati elaborati si evidenzia una migliore performance del kit diagnostico IZSLER per l’identificazione e sierotipizzazione di virus aftosi rispetto al test ELISA del WRL, e una migliore performance dei kit IZSLER sierologici rispetto a quelli commerciali.

Nome della Prova Interlaboratorio:

Prova interlaboratorio per il test ELISA di screening per la ricerca di anticorpi verso il virus della Malattia Vescicolare del Suino

Nel 2017 il LNR ha svolto l’attività preparatoria per un Proficiency Test per la prova sierologica di screening (ELISA competitiva), eseguita per l’attuazione del Piano Nazionale di sorveglianza della malattia da 10 IIZZSS oltre che dal CERVES. I risultati erano attesi entro il 15 dicembre 2017, ma a causa di alcuni ritardi il report finale sarà prodotto nel 2018.

Per il PT MVS 2017 sono stati selezionati sieri e/o costruiti campioni in grado di simulare sieri con diverse concentrazioni di anticorpi, privilegiando concentrazioni basse in considerazione della attuale situazione epidemiologica di indennità per tutte le regioni ad eccezione di una, e la conseguente necessità di operare con elevata sensibilità.  I campioni sono stati analizzati presso il LNR in ripetute repliche per produrre il risultato atteso di riferimento. Sono stati allestiti i pannelli anonimi per ciascun istituto partecipante, il cui invio è programmato nel mese di novembre.

Matrici

N. 12 sieri suini, con diverse concentrazioni di anticorpi, privilegiando concentrazioni basse.

Analiti

Anticorpi anti-MVS

Luogo e periodo di svolgimento

Laboratori degli IIZZSS coinvolti nell’attuazione del Piano nazionale MVS, periodo dicembre 2017

Numero e tipo di laboratori partecipanti

N. 10 IIZZSS referenti, oltre al CERVES.

Follow up

Tutti i laboratori hanno ottenuto esiti conformi, per cui non si è presentata necessità di introdurre azioni correttive. I risultati hanno confermato la robustezza del metodo e l’affidabilità dei risultati del Piano nazionale MVS come diretta conseguenza della standardizzazione e armonizzazione dei risultati ottenuti dai diversi laboratori.

Valutazione complessiva

I 10 IIZZSS partecipanti eseguono la prova da oltre 20 anni con kit prodotto e fornito dal LNR/CERVES: i risultati dei molteplici proficiency test organizzati nel corso di questi anni, sempre conformi per tutti i campioni positivi e negativi, con minime variazioni per i campioni borderline, confermano le performance e l’attendibilità dei risultati prodotti dai laboratori, così come la robustezza del metodo.