RELAZIONE ANNUALE AL PNI 2014
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Echinococcosi - LNR
FONTE: Ministero della Salute
LNR per l’Echinococcosi
Macroarea: Attività trasversali
Settore: Laboratori Nazionali Riferimento
Obiettivi
L’organizzazione e l’esecuzione del PT si è posta come obiettivi:
- l’armonizzazione, fra diversi laboratori, dell’applicazione del metodo CeNRE/02 rev 01 “Identificazione della specie Echinococcus granulosus(E.g.) mediante PCR”;
- la definizione delle azioni correttive da intraprendere in caso di risultati discordanti tra i laboratori;
- la valutazione delle procedure di preparazione e spedizione di materiale di riferimento per la diagnostica parassitologica di E.g. dal Centro di Referenza ai laboratori degli IIZZSS Nazionali e la loro applicabilità.
Scelta del campione
Per la preparazione dei campioni positivi si è utilizzato DNA di referenza estratto, secondo l’istruzione CeNRE I/02 “Estrazione di DNA da protoscolici di Echinococcus spp.”, da protoscolici di Echinococcus granulosus, ottenuti da liquido cistico prelevato da organi ovini infestati valutati secondo il metodo di prova “Ricerca ed identificazione di cisti di Echinococcus granulosus in visceri parassitati” siglato con CeNRE/01. La standardizzazione dei campioni è stata valutata con la lettura della concentrazione del DNA con lo spettrofotometro. I campioni sono stati scelti in base alla loro positività secondo il metodo di prova CeNRE/02 rev.01. Per i campioni negativi è stata utilizzata acqua milli-Q sterile.
Preparazione del campione
I campioni da inviare ai laboratori sono stati codificati con un numero da 1 a 3: per ciascun laboratorio si è deciso di inviare un campione positivo per la presenza di DNA estratto da protoscolici di Echinococcus granulosus e due negativi.
Manipolazione e conservazione dei campioni
I campioni sono stati identificati, etichettati e separati. Per assicurare la spedizione in contemporanea per tutti i laboratori destinatari, i campioni sono stati stoccati nel freezer -20°C (apparecchio di processo 9CE/C/01) fino al momento della presa in consegna da parte della ditta di logistica.
La stabilità dei campioni di DNA è elevata, tuttavia è stato raccomandato ai laboratori aderenti al PT il controllo della temperatura al momento dell’apertura del contenitore e la conservazione a temperatura di refrigerazione.
Spedizione e logistica
Il CeNRE si avvale della convenzione stabilita dall’IZS Sardegna con una ditta di logistica.
Il gruppo di lavoro ha gestito la preparazione del campione fino alla chiusura del contenitore primario e secondario, mentre la chiusura del collo e le fasi di trasporto fino alla consegna ai laboratori destinatari sono stati gestiti sotto la responsabilità della ditta di logistica.
Discussione
Il proficiency test è stato elaborato sulla simulazione di un campionamento di organi da ospiti intermedi e sulla successiva analisi degli stessi seguendo il metodo di prova CeNRE/02 rev.1.
Il laboratorio nazionale di riferimento ha provveduto alla preparazione di 6 gruppi di 3 campioni anonimi siglati da 1 a 3 per la conduzione di un test qualitativo. I risultati delle analisi qualitative vengono valutati in base alla concordanza/discordanza con il risultato atteso.
La tecnica appropriata per la valutazione del test è la comparazione dei risultati dei partecipanti con i valori assegnati: se sono identici la performance è accettabile, se non sono identici è necessario un giudizio degli esperti per determinare l’idoneità della prova e del risultato. E’ stato previsto che in alcune situazioni il Proficiency Testing Provider possa riesaminare i risultati dei partecipanti e determinare che il campione o la prova non siano adeguati per la valutazione o che il valore assegnato non sia corretto.
Per tutte le prove testate le valutazioni del proficiency test 2014 sono risultate positive. Tutti i laboratori coinvolti (codice A, B, C, D, E, F ) hanno dimostrato di aver ben applicato il metodo e di riuscire ad eseguire diagnosi di E.g. mediante metodiche biomolecolari in conformità al metodo.
Criticità
Nell’edizione 2014 del PT non si sono rilevate criticità segnalabili.
Analisi critica complessiva dell’ attività svolta e dei risultati ottenuti nel quadriennio 2011-2014
Dal 2012 il CeNRE organizza proficiency test (PT) sia per la prova Cenre/01 “Ricerca ed identificazione di cisti di Echinococcus granulosus in visceri parassitati” da utilizzare nella diagnosi di Echinococcus granulosus (E.g) negli ospiti intermedi, che per la prova di “Identificazione della specie Echinococcus granulosus (E.g.) mediante PCR”, metodo di prova registrato con la sigla CeNRE 02/rev.01. In questo secondo caso nel 2013 il PT è stato preceduto da uno stage formativo per tecnici di laboratorio finalizzato al perfezionamento pratico della metodica da trasmettere. A tale evento formativo hanno partecipato: cinque tecnici di laboratorio per l’esecuzione della prova, due dirigenti veterinari ed una biologa come uditori. L’evento è stato accreditato per 12 crediti formativi E.C.M. Per l’assegnazione dei crediti si è deciso di contestualizzare la valutazione del PT con la valutazione dell’apprendimento dei discenti durante lo stage. Tutti i discenti hanno dimostrato di avere ben appreso la metodica trasmessa.
La trasmissione dei metodi di prova in forma non controllata ai laboratori aderenti al PT è stata sempre effettuata dal Responsabile della Qualità dell’IZS Sardegna.
Ai diversi PT si è sempre dato avvio con la costituzione di un network di laboratori che, a seguito dell’implementazione delle metodiche diagnostiche, collaborino con il CeNRE per una corretta raccolta dati epidemiologici su E.g.
I laboratori che hanno partecipato su adesione volontarianei diversi anni sono stati:
2012:
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
Laboratorio di Patologia animale e stabulario, Diagnostica generale e coordinamento Sanità e Benessere Animale. Via Bologna 148 -10154 Torino.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
- Laboratorio di Parassitologia, Diagnostica specialistica e istopatologia. Viale dell'Università, 10 - 35020 Legnaro (PD)
- Laboratorio di parassitologia, Sezione diagnostica territoriale del Trentino. Via Lavisotto 129, SCT5 Trento
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche
Laboratorio di Parassitologia ed Entomologia. Via G. Salvemini, n°1 06126 Perugia
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia
Laboratorio di Parassitologia. Via G. Marinuzzi, 3 90129 Palermo
2013:
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
Lab. Microbiologia Molecolare e Analisi Genomiche. Via Bologna 148 -10154 Torino
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
Laboratorio di Parassitologia, Diagnostica specialistica e istopatologia. Viale dell'Università, 10 - 35020 Legnaro (PD)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e Toscana
Staff Biotecnologie. Via Appia Nuova, 1411- 00178 Roma (Capannelle)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche
Laboratorio di Diagnostica. Via G.Salvemini, 1 - 06126 PERUGIA
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia
Laboratorio di Parassitologia. Via G. Marinuzzi, 3 - 90129 PALERMO
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e Molise
Ricerca e Sviluppo Biotecnologie. Via Campo Boario, 64100 TERAMO
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna
Laboratorio di Anatomia Patologica del Dip. territoriale di Nuoro. Via F.lli Kennedy n°2, 08100 NUORO
Laboratorio di Sierologia e Virologia Diagnostica del Dip. Territoriale di Oristano
Via Atene - Zona Industriale - 09170 ORISTANO
2014:
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
Lab. Microbiologia Molecolare e Analisi Genomiche. Via Bologna 148 -10154 Torino
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
Laboratorio di Parassitologia, Diagnostica specialistica e istopatologia. Viale dell'Università, 10 - 35020 Legnaro (PD)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e Toscana
Staff Biotecnologie. Via Appia Nuova, 1411- 00178 Roma (Capannelle)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche
Laboratorio di Diagnostica. Via G.Salvemini, 1 - 06126 PERUGIA
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia
Laboratorio di Parassitologia. Via G. Marinuzzi, 3 - 90129 PALERMO
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e Molise
Ricerca e Sviluppo Biotecnologie. Via Campo Boario, 64100 TERAMO
E’ stato costituito un gruppo di lavoro arruolando presso il PT Provider varie figure specialistiche (veterinari, biologi e tecnici di laboratorio).
La scelta è stata sempre orientata verso un PT qualitativo per i laboratori di parassitologia, anatomia patologica, diagnostica e biologia molecolare degli IIZZSS della rete nazionale.
Le valutazioni delle prove testate nei PT dal 2012 al 2014 sono sempre risultate positive per tutti i partecipanti.
Solo nel 2013 tra gli 8 laboratori coinvolti solo 1 non ha inviato l’esito del test entro i termini previsti ed indicati, per cui non è stato possibile effettuarne la valutazione. Pertanto è stato ritenuto non idoneo.
Le criticità riscontrate da parte del gruppo di lavoro del CeNRE per la preparazione dei PT hanno riguardato la fase della preparazione dei campioni utili con il metodo CeNRE01 del 2012 e la logistica per l’invio nelle sedi dei partecipanti in modo da rispettare i tempi opportuni per l’analisi dei campioni freschi. Tali criticità hanno riguardato prevalentemente il reperimento di campioni d’organo negativi (si è infatti riprodotta una simulazione di un “campionamento tipo” negli stabilimenti di macellazione) e la preparazione di provette di liquido cistico con positività, negatività e vitalità dei protoscolici standardizzate. Anche la logistica dei campioni, come previsto, si è confermata essere un altro importante punto critico; l’invio di materiale biologico vivo e vitale non può prescindere dal principio di stabilità e tracciabilità delle temperature, oltre che di consegna nei tempi previsti. Pertanto nell’edizione del 2012 si è dovuta omettere la valutazione di una delle prove proprio per l’impossibilità di controllare che tale principio venisse rispettato. L’azione correttiva prevista per le edizioni successive nonché per l’invio di campioni biologici “freschi” come materiale di riferimento è stata prevedere l’utilizzo di un data logger da inserire nel collo di spedizione.
Conclusioni
Nel report scientifico presentato all’EFSA (http://www.efsa.europa.eu/it/supporting/doc/36e.pdf) e pubblicato nel febbraio 2010 (Development of harmonised schemes for the monitoring and reporting of Echinococcus in animals and foodstuffs in the European Union 2010), viene suggerita l’identificazione dei ceppi presenti nel territorio nazionale e lo studio della correlazione del ceppo con la fertilità della cisti e con la specie dell’ospite. Le attività di un Laboratorio Nazionale di Riferimento hanno come presupposto fondamentale la costituzione di un network di laboratori che abbiano competenze specifiche accertate su diagnosi di Echinococcus granulosus e siano abilitati ad alimentare un flusso informativo con dati validabili dal LNR.
Con i PT si sta avendo la possibilità di raggiungere tali obiettivi che hanno come fine ultimo la costruzione di una mappa epidemiologica nazionale.
Si ritiene che tutte le edizioni dal 2012 a oggi abbiano ottenuto un buon esito, utile oltre che alla costituzione del network di laboratori anche alla rilevazione di criticità nell’organizzazione di una rete di condivisione di campioni biologici.
Vedi anche