A cura di:
Direzione generale per l'igiene e la sicurezza degli alimenti e la nutrizione
Web editing:
M. DE MARTINO
Cap. 2B - CRN ittiopatologia
CRN per l'ittiopatologia
IZS delle Venezie
Sezione Provinciale
Basaldella di Campoformido (Udine)
Al Centro di Referenza Nazionale per l’ittiopatologia affluiscono tre diversi laboratori :
- Laboratorio di riferimento per le malattie dei pesci
- Laboratorio di riferimento per le malattie dei molluschi
- Laboratorio di riferimento per le malattie dei crostacei
1) Elenco delle attività di analisi designate
Le seguenti attività vengono svolte nei laboratori del Centro di Referenza Nazionale:
a) Laboratorio di riferimento per le malattie dei pesci
| DENOMINAZIONE PROVA | TECNICA DI PROVA | METODO DI PROVA | PROVA ACCREDITATA SINAL |
|---|---|---|---|
| Esame virologico secondo la Decisione 2001/183/CE | Isolamento su colture cellulari | Dec CE 2001/183 GU CE L67 09/03/2001 | Si |
| Ricerca del virus della viremia primaverile della carpa mediante isolamento su colture cellulari | Isolamento su colture cellulari | Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.4. | Si |
| Ricerca del virus della necrosi pancreatica infettiva mediante isolamento su colture cellulari | Isolamento su colture cellulari | Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.8. | Si |
| Identificazione del virus della viremia primaverile della carpa mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.4. | Si |
| Identificazione del virus della necrosi pancreatica infettiva mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.8. | Si |
| Identificazione del virus della setticemia emorragica virale mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CE | Immunofluorescenza su colture cellulari | Dec CE 2001/183 GU CE L67 09/03/2001 | Si |
| Identificazione del virus della necrosi ematopoietica infettiva mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CE | Immunofluorescenza su colture cellulari | Dec CE 2001/183 GU CE L67 09/03/2001 | Si |
| Ricerca del virus della encefalopatia e retinopatia virale e sua identificazione mediante isolamento su colture cellulari | Isolamento su colture cellulari | PDP ITT 021 Rev.01 | No |
| Esame virologico per la ricerca di iridovirus ed herpesvirus del pesce gatto | Isolamento su colture cellulari | PDP ITT 22 Rev. 00 | No |
| Identificazione dell’agente dell’iridovirosi del pesce gatto mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | PDP ITT 23 Rev.00 | No |
| Ricerca di RNA del virus della necrosi ematopoietica infettiva (IHN) mediante nested - PCR | PCR | PDP ITT 15 Rev.00 | No |
| Ricerca di RNA del virus della Setticemia Emorragica Virale (VHS) mediante RT-PCR | PCR | PDP ITT 16 Rev.00 | No |
| Ricerca di RNA del virus della Encefalopatia e retinopatia virale (VER) mediante RT- PCR ONE - STEP | PCR | PDP ITT 17 Rev.00 | No |
| Ricerca di RNA del virus della Encefalopatia e retinopatia virale (VER) mediante eminested -PCR | PCR | PDP ITT 18 Rev.00 | No |
| Ricerca del DNA di herpes virus della Carpa Koi (KHV) mediante PCR | PCR | PDP ITT 19 Rev.00 | No |
| Ricerca di Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida nelle specie ittiche | Esame colturale | PDP ITT 41 Rev.00 | No |
| Ricerca di Aeromonas hydrophila nelle specie ittiche | Esame colturale | PDP ITT 42 Rev.00 | No |
| Test di sensibilità agli antimicrobici dei ceppi batterici isolati da animali acquatici (NCCLS M42 R 2003) | Metodo di Kirby Bauer | PDP ITT 43 Rev.00 | No |
| Ricerca di Lactococcus garvieae nelle specie ittiche | Esame colturale | PDP ITT 44 Rev.00 | No |
| Ricerca di Yersinia ruckeri nelle specie ittiche | Esame colturale | PDP ITT 45 Rev.00 | No |
| Ricerca di Vibrio anguillarum nelle specie ittiche marine | Esame colturale | PDP ITT 47 Rev.00 | No |
| Ricerca di Photobacterium damselae subsp. piscicida nelle specie ittiche marine | Esame colturale | PDP ITT 48 Rev.00 | No |
| Identificazione di Lactococcus garvieaemediante PCR | PCR | PDP ITT 49 Rev.00 | No |
| Esame batteriologico nelle specie ittiche | Esame colturale | PDP ITT 50 Rev.00 | No |
| Titolazione anticorpale mediante la tecnica della microagglutinazione in salmonidi vaccinati contro la Lattococcosi | Microagglutinazione | PDP ITT 51 Rev.00 | No |
b) Laboratorio di riferimento per le malattie dei molluschi:
| Ricerca di Bonamia sp. in Ostrea edulis | Esame istologico | PDP ITT 31 Rev.02 | No |
| Ricerca di Marteilia sp. in Ostrea edulis | Esame istologico | PDP ITT 32 Rev.02 | No |
| Ricerca di Marteilia sp. in Mytilus galloprovincialis | Esame istologico | PDP ITT 33 Rev.02 | No |
| Ricerca di Perkinsus sp. in Ruditapes spp. | Esame istologico | PDP ITT 34 Rev.02 | No |
| Ricerca di Bonamia sp. in Ostrea edulis | Esame citologico | PDP ITT 35 Rev.01 | No |
| Ricerca di Marteilia sp. in Ostrea edulis | Esame citologico | PDP ITT 36 Rev.01 | No |
| Ricerca di Marteilia sp. in Mytilus galloprovincialis | Esame citologico | PDP ITT 37 Rev.01 | No |
| Ricerca di Perkinsus sp. in Ruditapes spp. (metodo colturale da branchia) | Esame microscopico | PDP ITT 38 Rev.01 | No |
| Ricerca di Perkinsus sp. in Ruditapes spp. (metodo colturale quantitativo) | Esame microscopico | PDP ITT 39 Rev.01 | No |
| Ricerca di parassiti in organismi acquatici (metodo istologico) | Esame istologico | PDP ITT 40 Rev.02 | No |
2) Descrizione dei sistemi di gestione e di controllo della qualità applicati nell’ambito del CRN
Nell’ambito del CRN per l’ittiopatologia la gestione ed il controllo della qualità possono variare tra un laboratorio e l’altro in funzione soprattutto delle specificità dei singoli laboratori.
Sistema di gestione e controllo della qualità applicati all’ ittiopatologia - Laboratorio di Ittiopatologia ( malattie virali)
L’approccio metodologico per l’Assicurazione Qualità delle prove accreditate eseguite dal CRN in ambito virologico è basato sulla partecipazione ai circuiti nazionale ed internazionale per la diagnosi delle malattie virali delle specie ittiche organizzati rispettivamente dai centri nazionale e comunitario di riferimento per le suddette patologie.
I due circuiti consistono nell’isolamento, identificazione e titolazione ( che viene eseguita su due o più linee cellulari sensibili) di cinque ceppi virali liofilizzati. Il laboratorio di virologia del CRN partecipa al circuito nazionale da esso organizzato con personale diverso rispetto a quello coinvolto nell’allestimento dello stesso. Tutti i tecnici di laboratori abilitati alle singole prove partecipano regolarmente a tali circuiti.
La riproducibilità e la ripetibilità delle prove accreditate sono inoltre verificate due volte l’anno mediante l’applicazione di ogni singola procedura di prova con materiale di riferimento. Le prove vengono eseguite tre volte dallo stesso operatore e in parallelo da personale diverso del laboratorio.
Infine, almeno due volte all’anno, vengono eseguite prove virologiche per testare la sensibilità dei substrati cellulari nei confronti dei virus oggetto di determinazione delle prove accreditate.
Nella tabella seguente vengono riepilogati gli approcci metodologici impiegati dal CRN per assicurare la qualità dei risultati ottenuti relativamente alle prove in ambito virologico.
| Procedura | Approccio metodologico per l’assicurazione dei risultati | Frequenza |
|---|---|---|
| Esame virologico scondo la decisione 2001/183/CE | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: a discrezione del Centro di Referenza Comunitario (generalmente annuale) Prove di ripetibilità e riproducibilità : semestrali Prove di sensibilità cellulare :semestrali |
| Identificazione del virus della Setticemia Emorragica Virale mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CE | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: a discrezione del Centro di Referenza Comunitario(generalmente annuale) Prove di ripetibilità e riproducibilità : semestrali Prove di sensibilità cellulare :semestrali |
| Ricerca virus della Necrosi Pancreatica Infettiva) mediante isoamento su colture cellulari (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th Ed. 2006 Chap. 2.1.8) | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: a discrezione del Centro di Referenza Comunitario (generalmente annuale) Prove di ripetibilità e riproducibilità : semestrali Prove di sensibilità cellulare :semestrali |
| Ricerca virus della Viremia Primaverile della Carpa mediante isoamento su colture cellulari (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th Ed. 2006 Chap. 2.1.4) | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: a discrezione del Centro di Referenza Comunitario (generalmente annuale) Prove di ripetibilità e riproducibilità : semestrali Prove di sensibilità cellulare :semestrali |
| Identificazione del virus della Necrosi Ematopoietica Infettiva mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CE | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: a discrezione del Centro di Referenza Comunitario (generalmente annuale) Prove di ripetibilità e riproducibilità : semestrali Prove di sensibilità cellulare :semestrali |
| Identificazione del virus della Necrosi Pancreatica Infettiva mediante immunofluorescenza (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th Ed. 2006 Chap. 2.1.8) | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: a discrezione del Centro di Referenza Comunitario (generalmente annuale) Prove di ripetibilità e riproducibilità : semestrali Prove di sensibilità cellulare :semestrali |
| Identificazione del virus della Viremia Primaverile della Carpa mediante immunofluorescenza (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th Ed. 2006 Chap. 2.1.4) | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: a discrezione del Centro di Referenza Comunitario (generalmente annuale) Prove di ripetibilità e riproducibilità : semestrali Prove di sensibilità cellulare :semestrali |
Sistema di gestione e controllo della qualità applicati all’ ittiopatologia – Laboratori di patologia dei pesci (malattie batteriche e parassitarie), patologia dei crostacei e patologia dei molluschi
L’approccio metodologico per l’Assicurazione Qualità delle prove accreditate eseguite presso i laboratori sopra indicati è basato sulla partecipazione periodica a circuiti interlaboratorio nazionali ed internazionali in ambito batteriologico e parassitologico . I laboratori di patologia dei pesci e dei molluschi partecipano per quanto riguarda gli aspetti di batteriologia il primo e di parassitologia il secondo ai circuiti nazionali da esso organizzati con personale diverso rispetto a quello coinvolto nell’allestimento degli stessi.
Nello specifico i due laboratori partecipano regolarmente ai seguenti circuiti:
| Procedura | Approccio metodologico per l’assicurazione dei risultati | Frequenza |
|---|---|---|
| Ricerca di Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Aeromonas hydrophila nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Lactococcus garvieae nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Yersinia ruckeri nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Vibrio anguillarum nelle specie ittiche marine | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Lactococcus garvieae nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Esame batteriologico nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Bonamia sp. in Ostrea edulis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Marteilia sp. in Ostrea edulis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Marteilia sp. in Mytilus galloprovincialis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Perkinsus sp. in Ruditapes spp. | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Bonamia sp. in Ostrea edulis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Marteilia sp. in Ostrea edulis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Marteilia sp. in Mytilus galloprovincialis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
I risultati conseguiti nell’ambito dei suddetti circuiti vengono riportati in carte di controllo al fine di verificare l’andamento nel tempo delle performance degli operatori abilitati alle prove. Le prestazioni dei due Laboratori sono mantenute sotto controllo verificando annualmente i parametri di validazione attraverso l’elaborazione dei risultati dei circuiti interlaboratorio. A tale scopo viene valutata la concordanza (k di Cohen) tra i dati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti.
Per quanto riguarda le malattie dei crostacei attualmente non sono ancora attivi circuiti internazionali di verifica: il laboratorio dispone di controlli positivi forniti dal Centro di Referenza Comunitario (CEFAS – UK) che vengono utilizzati in parallelo durante l’analisi dei campioni sospetti.
3) Descrizione dei meccanismi in essere per la pianificazione e la realizzazione delle prove interlaboratorio di confronto e indicazione del programma di tali prove per la durata del piano.
Il CRN organizza , nell’ambito dei tre diversi laboratori di riferimento i circuiti inter-laboratori di cui alla tabella seguente
| N° | ENTE ORGANIZZATORE | ANALISI /PARAMETRI ANALIZZATI | MATRICE |
|---|---|---|---|
1
| Centro di Referenza Nazionale – IZS venezie Circuito Aqua IV IZS | Identificazione e titolazione ceppi virali | 5 ampolle contenenti ceppi virali liofilizzati |
| 2 | Centro di Referenza Nazionale – IZS venezie Circuito Aqua IB IZS | Identificazione batteri patogeni per i pesci | 6 ampolle contenenti ceppi batterici liofilizzati |
| 3 | Centro di Referenza Nazionale – IZS venezie Circuito Aqua IZS Parassitologia molluschi | Identificazione di protozoi in preparati citologici ed istologici | Preparati istologici e citologici |
Le principali caratteristiche dei diversi circuiti, distinte per laboratorio di appartenenza, sono descritte di seguito :
Laboratorio di patologia dei pesci (patologie di origine virale)
Il Centro di Referenza Nazionale per l’Ittiopatologia organizza annualmente un circuito interlaboratorio in ambito virologico destinato agli Istituti Zooprofilattici che eseguono prove di ittiovirologia. Il circuito viene organizzato dal CRN seguendo le stesse modalità adottate del centro di referenza comunitario nei circuiti proposti annualmente ai centri nazionali. Tale circuito prevede che i partecipanti eseguano l’isolamento, l’identificazione e la titolazione di cinque ceppi virali liofilizzati. I ceppi inviati nell’ambito del circuito sono ceppi di riferimento del CRN e consistono nei principali agenti virali responsabili di malattia nelle specie ittiche, specialmente di quelle previste dal D.lgs 148/2008 che ha recepito la direttiva 2006/88/CE .Scopo del circuito è quello di verificare, per ogni laboratorio partecipante, l’efficienza nella identificazione degli agenti virali e valutare la sensibilità delle linee cellulari in uso nei diversi laboratori.
I dati raccolti nell’ambito del circuito vengono rielaborati al fine di preparare un report finale che viene inviato ai singoli partecipanti.
Laboratorio di patologia dei pesci ( patologie di origine batterica )
Per quanto riguarda le malattie batteriche, il CRN organizza annualmente un circuito internazionale a cui hanno partecipato, nel corso del 2009, 10 II.ZZ.SS. e 7 partner stranieri (Danimarca, Norvegia, Spagna, Slovacchia, Estonia, Olanda, Irlanda). Il ring trial consisteva nella identificazione di ceppi batterici patogeni per gli organismi acquatici, di referenza o di campo, liofilizzati ed anonimi. Il punteggio utilizzato per esprimere un giudizio sulle performances del laboratorio variava in base alla capacità di identificare correttamente genere e specie del microrganismo patogeno. I risultati del circuito interlaboratorio sono stata valutati verificando la concordanza (k di Cohen) tra i dati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti.
Laboratorio di patologia dei molluschi
Il Laboratorio di Riferimento Nazionale per la Patologia dei molluschi organizza annualmente un circuito interlaboratorio in ambito parassitologico destinato agli Istituti Zooprofilattici che eseguono prove di patologia molluschi. Il circuito viene organizzato dal CRN seguendo le stesse modalità adottate del centro di referenza comunitario nei circuiti proposti annualmente ai centri nazionali. Tale circuito prevede che i partecipanti eseguano l’identificazione di alcuni protozoi patogeni, tramite lettura di preparati citologici ed istologici. I vetrini, inviati nell’ambito del circuito fanno parte del materiale di riferimento del CRN e consistono nei principali agenti patogeni, segnatamente protozoi, responsabili di malattia in molluschi bivalvi allevati in Italia e previste dal D.Lgs 148/2008. Scopo del circuito è quello di verificare, per ogni laboratorio partecipante, l’efficienza degli operatori coinvolti nella identificazione degli agenti patogeni.
I dati raccolti nell’ambito del circuito vengono rielaborati al fine di preparare un report finale che viene inviato ai singoli partecipanti.
I risultati del circuito interlaboratorio sono stata valutati verificando la concordanza (k di Cohen) tra i dati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti.
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