A cura di:
Direzione generale per l'igiene e la sicurezza degli alimenti e la nutrizione
Web editing:
M. DE MARTINO
Cap. 2B - LNR Malattie dei pesci
LNR per le Malattie dei Pesci
Centro di referenza nazionale per l’ittiopatologia - Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
V.le dell’Università, 10, 35020 Legnaro (PD)
www.izsvenezie.it
Il Laboratorio di riferimento per le malattie dei pesci rientra insieme al Laboratorio di riferimento per le malattie dei molluschi e il Laboratorio di riferimento per le malattie dei crostacei nel Centro di Referenza Nazionale per l’ittiopatologia
1) Elenco delle attività di analisi designate
Il Laboratorio di riferimento per le malattie dei pesci esegue le seguenti prove:
| DENOMINAZIONE PROVA | TECNICA DI PROVA | METODO DI PROVA | PROVA ACCREDITATA SINAL | |
|---|---|---|---|---|
| Esame virologico secondo la Decisione 2001/183/CE | Isolamento su colture cellulari | Dec CE 2001/183 GU CE L67 09/03/2001 | Si | |
| Ricerca del virus della viremia primaverile della carpa mediante isolamento su colture cellulari | Isolamento su colture cellulari | Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.4. | Si | |
| Ricerca del virus della necrosi pancreatica infettiva mediante isolamento su colture cellulari | Isolamento su colture cellulari | Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.8. | Si | |
| Identificazione del virus della viremia primaverile della carpa mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.4. | Si | |
| Identificazione del virus della necrosi pancreatica infettiva mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.8. | Si | |
| Identificazione del virus della setticemia emorragica virale mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CE | Immunofluorescenza su colture cellulari | Dec CE 2001/183 GU CE L67 09/03/2001 | Si | |
| Identificazione del virus della necrosi ematopoietica infettiva mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CE | Immunofluorescenza su colture cellulari | Dec CE 2001/183 GU CE L67 09/03/2001 | Si | |
| Ricerca di RNA del virus della necrosi ematopoietica infettiva (IHN) mediante nested - PCR | PCR | PDP ITT 15 Rev.00 | No | |
| Ricerca di RNA del virus della Setticemia Emorragica Virale (VHS) mediante RT-PCR | PCR | PDP ITT 16 Rev.00 | No | |
| Ricerca di RNA del virus della Encefalopatia e retinopatia virale (VER) mediante RT- PCR ONE - STEP | PCR | PDP ITT 17 Rev.00 | No | |
| Ricerca di RNA del virus della Encefalopatia e retinopatia virale (VER) mediante eminested -PCR | PCR | PDP ITT 18 Rev.00 | No | |
| Ricerca del DNA di herpes virus della Carpa Koi (KHV) mediante PCR | PCR | PDP ITT 19 Rev.00 | No | |
| Ricerca del virus della encefalopatia e retinopatia virale e sua identificazione mediante isolamento su colture cellulari | Isolamento su colture cellulari | PDP ITT 021 Rev.01 | No | |
| Esame virologico per la ricerca di iridovirus ed herpesvirus del pesce gatto | Isolamento su colture cellulari | PDP ITT 22 Rev. 00 | No | |
| Identificazione dell’agente dell’iridovirosi del pesce gatto mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | PDP ITT 23 Rev.00 | No | |
| Ricerca di RNA del virus della encefaloretinopatia virale mediante Real Time PCR (rPCR) | Real time RT-PCR | PDP ITT26 Rev 00 | No | |
| Identificazione del virus della encefaloretinopatia virale mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | PDP ITT27 Rev 00 | No | |
| Esame virologico per la ricerca dell’herpesvirus della carpa koi mediante isolamento su colture cellulari | Isolamento su colture cellulari | PDP ITT54 Rev.00 | No | |
| Identificazione del Rhabdovirus del pesce gatto mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | PDP ITT55 Rev 00 | No | |
| Ricerca del DNA dell’herpesvirus della carpa koi mediante nested PCR | Nested PCR | PDP ITT56 Rev 00 | No | |
| Ricerca dell’RNA del virus dell’anemia infettiva del salmone (ISAV) mediante rRT-PCR | Real time RT-PCR | PDP ITT57 Rev 00 | No | |
| Identificazione dell’herpesvirus della carpa koi mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | PDP ITT58 Rev 00 | No | |
| Sieroneutralizzazione con metodo della riduzione del 50% delle placche per la diagnosi di necrosi ematopoietica infettiva | Sieroneutralizzazione | PDP ITT 62 Rev.00 | No | |
| Sieroneutralizzazione con metodo della riduzione del 50% delle placche per la diagnosi di setticemia emorragica virale | Sieroneutralizzazione | PDP ITT 63 Rev.00 | No | |
| Sieroneutralizzazione con metodo delle 100 dosi infettanti per la diagnosi di encefalopatia e retinopatia virale | Sieroneutralizzazione | PDP ITT 64 Rev.00 | No | |
| Esame virologico mediante isolamento su coltura cellulare | Isolamento su colture cellulari | PDP ITT 69 Rev.00 | No | |
| Ricerca del DNA di Herpesvirus dei ciprinidi (CyHV) mediante nested-PCR | Nested PCR | PDP ITT87 Rev 00 | No | |
| Ricerca del DNA di Ranavirus mediante PCR per l’amplificazione del segmento codificante per il neurofilamento H1 e successiva genotipizzazione tramite sequenziamento | PCR | PDP ITT89 Rev 00 | No | |
| Rilevazione del RNA del virus necrosi ematopoietica infettiva NEI/IHN mediante rRT-PCR | Real time RT-PCR | PDP ITT90 Rev 00 | No | |
| Rilevazione del RNA del virus della setticemia emorragica virale SEV/VHS mediante rRT-PCR | Real time RT-PCR | PDP ITT96 Rev 00 | No | |
| Identificazione dell’ Herpesvirus del pesce gatto mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | PDP ITT98 Rev 00 | No | |
| Isolamento su colture cellulari | PDP ITT 99 Rev.00 | No | |
| Identificazione Herpesvirus dell'anguilla mediante immunofluorescenza | Immunofluorescenza su colture cellulari | PDP ITT100 Rev 00 | No | |
Rilevazione di DNA dell’ Herpesvirus della Carpa Koi (KHV) mediante Real Time PCR | Real time RT-PCR | PDP ITT101 Rev 00 | No | |
| Rilevazione del RNA del virus della necrosi pancreatica infettiva IPN/NPI mediante rRT_PCR | Real time RT-PCR | PDP ITT102 Rev 00 | No |
2) Descrizione dei sistemi di gestione e di controllo della qualità applicati nell’ambito del CRN
Nell’ambito del CRN per l’ittiopatologia la gestione ed il controllo della qualità possono variare tra un laboratorio e l’altro in funzione soprattutto delle specificità dei singoli laboratori.
Sistema di gestione e controllo della qualità applicati all’ ittiopatologia - Laboratorio di Ittiopatologia (malattie virali)
L’approccio metodologico per l’Assicurazione Qualità delle prove accreditate eseguite dal CRN in ambito virologico è basato sulla partecipazione ai circuiti nazionale ed internazionale per la diagnosi delle malattie virali delle specie ittiche organizzati rispettivamente dai centri nazionale e comunitario di riferimento per le suddette patologie. I due circuiti consistono nell’isolamento, identificazione e titolazione (che viene eseguita su due o più linee cellulari sensibili) di cinque ceppi virali liofilizzati. Il laboratorio di virologia del CRN partecipa al circuito nazionale da esso organizzato con personale diverso rispetto a quello coinvolto nell’allestimento dello stesso. Tutti i tecnici di laboratori abilitati alle singole prove partecipano regolarmente a tali circuiti.
La riproducibilità e la ripetibilità delle prove accreditate sono inoltre verificate due volte l’anno mediante l’applicazione di ogni singola procedura di prova con materiale di riferimento. Le prove vengono eseguite tre volte dallo stesso operatore e in parallelo da personale diverso del laboratorio.
Infine, almeno due volte all’anno, vengono eseguite prove virologiche per testare la sensibilità dei substrati cellulari nei confronti dei virus oggetto di determinazione delle prove accreditate.
Nella tabella seguente vengono riepilogati gli approcci metodologici impiegati dal CRN per assicurare la qualità dei risultati ottenuti relativamente alle prove in ambito virologico.
Dal 2010, il centro di referenza comunitario ha aggiunto al tradizionale circuito per le metodiche virologiche, un circuito specifico per le metodiche biomolecolari per le seguenti patologie: KHV, ISA e EUS al quale il CNR partecipa con regolarità.
| Procedura | Approccio metodologico per l’assicurazione dei risultati | Frequenza |
|---|---|---|
| Esame virologico scondo la decisione 2001/183/CE | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali |
| Identificazione del virus della Setticemia Emorragica Virale mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CE | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali |
| Ricerca virus della Necrosi Pancreatica Infettiva) mediante isoamento su colture cellulari (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th Ed. 2006 Chap. 2.1.8) | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali |
| Ricerca virus della Viremia Primaverile della Carpa mediante isoamento su colture cellulari (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th Ed. 2006 Chap. 2.1.4) | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali Prove di sensibilità cellulare: semestrali |
| Identificazione del virus della Necrosi Ematopoietica Infettiva mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CE | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali Prove di sensibilità cellulare: semestrali |
| Identificazione del virus della Necrosi Pancreatica Infettiva mediante immunofluorescenza (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th Ed. 2006 Chap. 2.1.8) | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali Prove di sensibilità cellulare: semestrali |
| Identificazione del virus della Viremia Primaverile della Carpa mediante immunofluorescenza (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th Ed. 2006 Chap. 2.1.4) | Ring Trial nazionale ed internazionale Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali Prove di sensibilità cellulare: semestrali |
Sistema di gestione e controllo della qualità applicati all’ ittiopatologia – Laboratori di patologia dei pesci (malattie batteriche e parassitarie), patologia dei crostacei e patologia dei molluschi
L’approccio metodologico per l’Assicurazione Qualità delle prove accreditate eseguite presso i laboratori sopra indicati è basato sulla partecipazione periodica a circuiti interlaboratorio nazionali ed internazionali in ambito batteriologico e parassitologico . I laboratori di patologia dei pesci e dei molluschi partecipano per quanto riguarda gli aspetti di batteriologia il primo e di parassitologia il secondo ai circuiti nazionali da esso organizzati con personale diverso rispetto a quello coinvolto nell’allestimento degli stessi.
Nello specifico i due laboratori partecipano regolarmente ai seguenti circuiti:
| Procedura | Approccio metodologico per l’assicurazione dei risultati | Frequenza |
|---|---|---|
| Ricerca di Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Aeromonas hydrophila nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Lactococcus garvieae nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Yersinia ruckeri nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Vibrio anguillarum nelle specie ittiche marine | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Lactococcus garvieae nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Esame batteriologico nelle specie ittiche | Ring Trial nazionale ed internazionale | Ring Trial nazionale: annuale Ring Trial internazionale: quadrimestrale |
| Ricerca di Bonamia sp. in Ostrea edulis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Marteilia sp. in Ostrea edulis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Marteilia sp. in Mytilus galloprovincialis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Perkinsus sp. in Ruditapes spp. | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Bonamia sp. in Ostrea edulis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Marteilia sp. in Ostrea edulis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
| Ricerca di Marteilia sp. in Mytilus galloprovincialis | Ring Trial nazionale | Ring Trial nazionale: annuale |
I risultati conseguiti nell’ambito dei suddetti circuiti vengono riportati in carte di controllo al fine di verificare l’andamento nel tempo delle performance degli operatori abilitati alle prove. Le prestazioni dei due Laboratori sono mantenute sotto controllo verificando annualmente i parametri di validazione attraverso l’elaborazione dei risultati dei circuiti interlaboratorio. A tale scopo viene valutata la concordanza (k di Cohen) tra i dati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti.
Per quanto riguarda le malattie dei crostacei attualmente non sono ancora attivi circuiti internazionali di verifica: il laboratorio dispone di controlli positivi forniti dal Centro di Referenza Comunitario (CEFAS – UK) che vengono utilizzati in parallelo durante l’analisi dei campioni sospetti.
3) Descrizione dei meccanismi in essere per la pianificazione e la realizzazione delle prove interlaboratorio di confronto e indicazione del programma di tali prove per la durata del piano.
Il CRN organizza , nell’ambito dei tre diversi laboratori di riferimento i circuiti inter-laboratori di cui alla tabella seguente
| N° | ENTE ORGANIZZATORE | ANALISI /PARAMETRI ANALIZZATI | MATRICE |
|---|---|---|---|
| 1 | Centro di Referenza Nazionale – IZS venezie Circuito Aqua IV IZS | Identificazione e titolazione ceppi virali | 5 ampolle contenenti ceppi virali liofilizzati |
| 2 | Centro di Referenza Nazionale – IZS venezie Circuito Aqua IB IZS | Identificazione batteri patogeni per i pesci | 6 ampolle contenenti ceppi batterici liofilizzati |
| 3 | Centro di Referenza Nazionale – IZS venezie Circuito Aqua IZS Parassitologia molluschi | Identificazione di protozoi in preparati citologici ed istologici | Preparati istologici e citologici |
Le principali caratteristiche dei diversi circuiti, distinte per laboratorio di appartenenza, sono descritte di seguito :
Laboratorio di patologia dei pesci (patologie di origine virale)
Il Centro di Referenza Nazionale per l’Ittiopatologia organizza annualmente un circuito interlaboratorio in ambito virologico destinato agli Istituti Zooprofilattici che eseguono prove di ittiovirologia. Il circuito viene organizzato dal CRN seguendo le stesse modalità adottate del centro di referenza comunitario nei circuiti proposti annualmente ai centri nazionali. Tale circuito prevede che i partecipanti eseguano l’isolamento, l’identificazione e la titolazione di cinque ceppi virali liofilizzati. I ceppi inviati nell’ambito del circuito sono ceppi di riferimento del CRN e consistono nei principali agenti virali responsabili di malattia nelle specie ittiche, specialmente di quelle previste dal D.lgs 148/2008 che ha recepito la direttiva 2006/88/CE. Scopo del circuito è quello di verificare, per ogni laboratorio partecipante, l’efficienza nella identificazione degli agenti virali e valutare la sensibilità delle linee cellulari in uso nei diversi laboratori.
I dati raccolti nell’ambito del circuito vengono rielaborati al fine di preparare un report finale che viene inviato ai singoli partecipanti. I risultati ottenuti vengono discussi durante un incontro organizzato dal DNR:
Laboratorio di patologia dei pesci ( patologie di origine batterica )
Per quanto riguarda le malattie batteriche, il CRN organizza annualmente un circuito internazionale a cui hanno partecipato, nel corso del 2009, 10 II.ZZ.SS. e 7 partner stranieri (Danimarca, Norvegia, Spagna, Slovacchia, Estonia, Olanda, Irlanda). Il ring trial consisteva nella identificazione di ceppi batterici patogeni per gli organismi acquatici, di referenza o di campo, liofilizzati ed anonimi. Il punteggio utilizzato per esprimere un giudizio sulle performances del laboratorio variava in base alla capacità di identificare correttamente genere e specie del microrganismo patogeno. I risultati del circuito interlaboratorio sono stata valutati verificando la concordanza (k di Cohen) tra i dati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti.
Laboratorio di patologia dei molluschi
Il Laboratorio di Riferimento Nazionale per la Patologia dei molluschi organizza annualmente un circuito interlaboratorio in ambito parassitologico destinato agli Istituti Zooprofilattici che eseguono prove di patologia molluschi. Il circuito viene organizzato dal CRN seguendo le stesse modalità adottate del centro di referenza comunitario nei circuiti proposti annualmente ai centri nazionali. Tale circuito prevede che i partecipanti eseguano l’identificazione di alcuni protozoi patogeni, tramite lettura di preparati citologici ed istologici. I vetrini, inviati nell’ambito del circuito fanno parte del materiale di riferimento del CRN e consistono nei principali agenti patogeni, segnatamente protozoi, responsabili di malattia in molluschi bivalvi allevati in Italia e previste dal D.Lgs 148/2008. Scopo del circuito è quello di verificare, per ogni laboratorio partecipante, l’efficienza degli operatori coinvolti nella identificazione degli agenti patogeni.
I dati raccolti nell’ambito del circuito vengono rielaborati al fine di preparare un report finale che viene inviato ai singoli partecipanti.
I risultati del circuito interlaboratorio sono stata valutati verificando la concordanza (k di Cohen) tra i dati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti.
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