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Ministero della Salute
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Piano Nazionale Integrato 2011-2014

A cura di:
Direzione generale per l'igiene e la sicurezza degli alimenti e la nutrizione

Web editing:
M. DE MARTINO



Cap. 2B - LNR Malattie dei pesci

Data di aggiornamento: 12 giugno 2014

LNR per le Malattie dei Pesci
Centro di referenza nazionale per l’ittiopatologia - Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
V.le dell’Università, 10, 35020 Legnaro (PD)
www.izsvenezie.it

 

Il Laboratorio di riferimento per le malattie dei pesci rientra insieme al Laboratorio di riferimento per le malattie dei molluschi e il Laboratorio di riferimento per le malattie dei crostacei nel Centro di Referenza Nazionale per l’ittiopatologia

 

1) Elenco delle attività di analisi designate

Il Laboratorio di riferimento per le malattie dei pesci esegue le seguenti prove:

DENOMINAZIONE PROVATECNICA DI PROVAMETODO DI PROVAPROVA ACCREDITATA SINAL
Esame virologico secondo la Decisione 2001/183/CEIsolamento su colture cellulariDec CE 2001/183 GU CE L67  09/03/2001Si
Ricerca del virus della viremia primaverile della carpa mediante isolamento su colture cellulariIsolamento su colture cellulariManual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.4.Si
Ricerca del virus della necrosi pancreatica infettiva mediante isolamento su colture cellulariIsolamento su colture cellulariManual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.8.Si
Identificazione del virus della viremia primaverile della carpa mediante immunofluorescenzaImmunofluorescenza su colture cellulariManual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.4.Si
Identificazione del virus della necrosi pancreatica infettiva mediante immunofluorescenzaImmunofluorescenza su colture cellulariManual of Diagnostic Test for Aquatic Animals OIE 5th Ed, 2006 Chap. 2.1.8.Si
Identificazione del virus della setticemia emorragica virale mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CEImmunofluorescenza su colture cellulariDec CE 2001/183 GU CE L67  09/03/2001Si
Identificazione del virus della necrosi  ematopoietica infettiva mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CEImmunofluorescenza su colture cellulariDec CE 2001/183 GU CE L67  09/03/2001Si
Ricerca di RNA del virus della necrosi ematopoietica infettiva (IHN) mediante nested - PCRPCRPDP ITT 15 Rev.00No
Ricerca di RNA del virus della Setticemia Emorragica Virale (VHS) mediante RT-PCRPCRPDP ITT 16 Rev.00No
Ricerca di RNA del virus della Encefalopatia e retinopatia virale (VER) mediante RT- PCR ONE - STEPPCRPDP ITT 17 Rev.00No
Ricerca di RNA del virus della Encefalopatia e retinopatia virale (VER) mediante eminested -PCRPCRPDP ITT 18 Rev.00No
Ricerca del DNA di herpes virus della Carpa Koi (KHV) mediante PCRPCRPDP ITT 19 Rev.00No
Ricerca del virus della encefalopatia e retinopatia virale e sua identificazione mediante isolamento su colture cellulariIsolamento su colture cellulariPDP ITT 021 Rev.01No
Esame virologico per la ricerca di iridovirus ed herpesvirus del pesce gattoIsolamento su colture cellulari

PDP ITT 22

Rev. 00

No
Identificazione dell’agente dell’iridovirosi del pesce gatto mediante immunofluorescenzaImmunofluorescenza su colture cellulariPDP ITT 23 Rev.00No
Ricerca di RNA del virus della encefaloretinopatia virale mediante Real Time PCR (rPCR)Real time RT-PCR

PDP ITT26

Rev 00

No
Identificazione del virus della encefaloretinopatia virale mediante immunofluorescenzaImmunofluorescenza su colture cellulari

PDP ITT27

Rev 00

No
Esame virologico per la ricerca dell’herpesvirus della carpa koi mediante isolamento su colture cellulariIsolamento su colture cellulari

PDP ITT54

Rev.00

No
Identificazione del Rhabdovirus del pesce gatto mediante immunofluorescenzaImmunofluorescenza su colture cellulari

PDP ITT55

Rev 00

No
Ricerca del DNA dell’herpesvirus della carpa koi mediante nested PCRNested PCR

PDP ITT56

Rev 00

No
Ricerca dell’RNA del virus dell’anemia infettiva del salmone (ISAV) mediante rRT-PCRReal time RT-PCR

PDP ITT57

Rev 00

No
Identificazione dell’herpesvirus della carpa koi mediante immunofluorescenzaImmunofluorescenza su colture cellulari

PDP ITT58

Rev 00

No
Sieroneutralizzazione con metodo della riduzione del 50% delle placche per la diagnosi di necrosi ematopoietica infettivaSieroneutralizzazione

PDP ITT 62

Rev.00       

No
Sieroneutralizzazione con metodo della riduzione del 50% delle placche per la diagnosi di setticemia emorragica virale Sieroneutralizzazione

PDP ITT 63

Rev.00       

No
Sieroneutralizzazione con metodo delle 100 dosi infettanti per la diagnosi di encefalopatia e retinopatia virale Sieroneutralizzazione

PDP ITT 64

Rev.00       

No
Esame virologico mediante isolamento su coltura cellulareIsolamento su colture cellulari

PDP ITT 69

Rev.00

No
Ricerca del DNA di Herpesvirus dei ciprinidi (CyHV) mediante nested-PCRNested PCR

PDP ITT87

Rev 00

No
Ricerca del DNA di Ranavirus mediante PCR per l’amplificazione del segmento codificante per il neurofilamento H1 e successiva genotipizzazione tramite sequenziamentoPCR

PDP ITT89

Rev 00

No
Rilevazione del RNA del virus necrosi ematopoietica infettiva NEI/IHN mediante rRT-PCRReal time RT-PCR

PDP ITT90

Rev 00

No
Rilevazione del RNA del virus della setticemia emorragica virale SEV/VHS mediante rRT-PCRReal time RT-PCR

PDP ITT96

Rev 00

No
Identificazione dell’ Herpesvirus del pesce gatto  mediante immunofluorescenzaImmunofluorescenza su colture cellulari

PDP ITT98

Rev 00

No
Esame virologico per la ricerca dell’Herpesvirus dell’anguilla
Isolamento su colture cellulari

PDP ITT 99

Rev.00

No
Identificazione Herpesvirus dell'anguilla mediante immunofluorescenzaImmunofluorescenza su colture cellulari

PDP ITT100

Rev 00

No

Rilevazione di DNA

dell’ Herpesvirus della Carpa Koi (KHV) mediante Real Time PCR

Real time RT-PCR

PDP ITT101

Rev 00

No
Rilevazione del RNA del virus della necrosi pancreatica infettiva IPN/NPI mediante rRT_PCRReal time RT-PCR

PDP ITT102

Rev 00

No

 

2) Descrizione dei sistemi di gestione e di controllo della qualità applicati nell’ambito del CRN

Nell’ambito del CRN per l’ittiopatologia  la gestione ed il controllo della qualità possono variare tra un laboratorio e l’altro in funzione soprattutto delle specificità dei singoli laboratori.

 

Sistema di gestione e controllo della qualità applicati all’ ittiopatologia - Laboratorio di  Ittiopatologia (malattie virali) 
L’approccio metodologico per l’Assicurazione Qualità delle prove accreditate eseguite dal CRN in ambito virologico è basato sulla partecipazione ai circuiti nazionale ed internazionale per la diagnosi delle malattie virali delle specie ittiche organizzati rispettivamente dai centri nazionale e comunitario di riferimento per le suddette patologie. I due circuiti consistono nell’isolamento, identificazione e titolazione (che viene eseguita su due o più linee cellulari sensibili)  di cinque ceppi virali liofilizzati. Il laboratorio di virologia del CRN partecipa al circuito nazionale da esso organizzato con personale diverso rispetto a quello coinvolto nell’allestimento dello stesso.  Tutti i tecnici di laboratori abilitati alle singole prove partecipano regolarmente a tali circuiti. 
La riproducibilità e la ripetibilità  delle prove accreditate sono inoltre verificate due volte l’anno mediante l’applicazione di ogni singola procedura di prova con materiale di riferimento. Le prove vengono eseguite tre volte dallo stesso operatore e in parallelo da personale diverso del laboratorio.
Infine, almeno due volte all’anno, vengono eseguite prove virologiche per testare la sensibilità dei substrati cellulari nei confronti dei virus oggetto di determinazione delle prove accreditate.
Nella tabella seguente vengono riepilogati gli approcci metodologici impiegati dal CRN per assicurare la qualità dei risultati ottenuti relativamente alle prove in ambito virologico.

Dal 2010, il centro di referenza comunitario ha aggiunto al tradizionale circuito per le metodiche virologiche, un circuito specifico per le metodiche biomolecolari per le seguenti patologie: KHV, ISA e EUS al quale il CNR partecipa con regolarità.

ProceduraApproccio metodologico per l’assicurazione dei risultatiFrequenza
Esame virologico scondo la decisione 2001/183/CERing Trial nazionale  ed internazionale
Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare

Ring Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: annuale

Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali
Prove di sensibilità cellulare: semestrali

Identificazione del virus della Setticemia Emorragica Virale mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CERing Trial nazionale  ed internazionale
Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare

Ring Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: annuale

Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali
Prove di sensibilità cellulare: semestrali

Ricerca virus della Necrosi Pancreatica Infettiva) mediante isoamento su colture cellulari (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th  Ed. 2006  Chap. 2.1.8)Ring Trial nazionale  ed internazionale
Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare

Ring Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: annuale

Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali
Prove di sensibilità cellulare: semestrali

Ricerca virus della Viremia Primaverile della Carpa mediante isoamento su colture cellulari (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th  Ed. 2006  Chap. 2.1.4)Ring Trial nazionale  ed internazionale
Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare
Ring Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali
Prove di sensibilità cellulare: semestrali
Identificazione del virus della Necrosi Ematopoietica Infettiva mediante immunofluorescenza secondo la decisione 2001/183/CERing Trial nazionale  ed internazionale
Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare
Ring Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali
Prove di sensibilità cellulare: semestrali
Identificazione del virus della Necrosi Pancreatica Infettiva mediante immunofluorescenza (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th  Ed. 2006  Chap. 2.1.8)Ring Trial nazionale  ed internazionale
Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare
Ring Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali
Prove di sensibilità cellulare: semestrali
Identificazione del virus della Viremia Primaverile della Carpa mediante immunofluorescenza (Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals OIE 5th  Ed. 2006  Chap. 2.1.4)Ring Trial nazionale  ed internazionale
Prove di ripetibilità e riproducibilità Prove di sensibilità cellulare
Ring Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale annuale Prove di ripetibilità e riproducibilità: semestrali
Prove di sensibilità cellulare: semestrali


Sistema di gestione e controllo della qualità applicati all’ ittiopatologia – Laboratori di patologia dei pesci (malattie batteriche e parassitarie), patologia dei crostacei e  patologia dei molluschi

L’approccio metodologico per l’Assicurazione Qualità delle prove accreditate eseguite presso i laboratori sopra indicati è basato sulla partecipazione periodica a circuiti interlaboratorio nazionali ed internazionali in ambito batteriologico e parassitologico . I laboratori di patologia dei pesci e dei molluschi partecipano per quanto riguarda gli aspetti di batteriologia il primo e di parassitologia il secondo ai circuiti nazionali da esso organizzati con personale diverso rispetto a quello coinvolto nell’allestimento degli stessi. 
Nello specifico i due  laboratori partecipano  regolarmente ai seguenti circuiti:

ProceduraApproccio metodologico per l’assicurazione dei risultatiFrequenza
Ricerca di Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida nelle specie itticheRing Trial nazionale  ed internazionaleRing Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: quadrimestrale
Ricerca di Aeromonas hydrophila nelle specie itticheRing Trial nazionale  ed internazionaleRing Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: quadrimestrale
Ricerca di Lactococcus garvieae nelle specie itticheRing Trial nazionale  ed internazionaleRing Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: quadrimestrale
Ricerca di Yersinia  ruckeri nelle specie itticheRing Trial nazionale  ed internazionaleRing Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: quadrimestrale
Ricerca di Vibrio anguillarum nelle specie ittiche marineRing Trial nazionale  ed internazionaleRing Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: quadrimestrale
Ricerca di Lactococcus garvieae nelle specie itticheRing Trial nazionale  ed internazionaleRing Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: quadrimestrale
Esame batteriologico nelle specie itticheRing Trial nazionale  ed internazionaleRing Trial nazionale: annuale
Ring Trial internazionale: quadrimestrale
Ricerca di Bonamia sp. in Ostrea edulisRing Trial nazionale Ring Trial nazionale: annuale
Ricerca di Marteilia sp. in Ostrea edulisRing Trial nazionale Ring Trial nazionale: annuale
Ricerca di Marteilia sp. in Mytilus galloprovincialisRing Trial nazionale Ring Trial nazionale: annuale
Ricerca di Perkinsus sp. in Ruditapes spp.Ring Trial nazionale Ring Trial nazionale: annuale
Ricerca di Bonamia sp. in Ostrea edulisRing Trial nazionale Ring Trial nazionale: annuale
Ricerca di Marteilia sp. in Ostrea edulisRing Trial nazionale Ring Trial nazionale: annuale
Ricerca di Marteilia sp. in Mytilus galloprovincialisRing Trial nazionale Ring Trial nazionale: annuale


I risultati conseguiti nell’ambito dei suddetti circuiti vengono riportati in carte di controllo al fine di verificare l’andamento nel tempo delle performance degli operatori abilitati alle prove. Le prestazioni dei due Laboratori sono mantenute sotto controllo verificando annualmente i parametri di validazione attraverso l’elaborazione dei risultati dei circuiti interlaboratorio.  A tale scopo viene valutata la concordanza (k di Cohen) tra i dati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti.

Per quanto riguarda le malattie dei crostacei attualmente non sono ancora attivi circuiti internazionali di verifica: il laboratorio dispone di controlli positivi forniti dal Centro di Referenza Comunitario (CEFAS – UK) che vengono utilizzati  in parallelo durante l’analisi dei campioni sospetti.

 

3) Descrizione dei meccanismi in essere per la pianificazione e la realizzazione delle prove interlaboratorio di confronto e indicazione del programma di tali prove per la durata del piano.

Il CRN organizza , nell’ambito dei tre diversi laboratori di riferimento i circuiti inter-laboratori di cui alla tabella seguente

ENTE
ORGANIZZATORE
ANALISI /PARAMETRI ANALIZZATIMATRICE
1Centro di Referenza Nazionale –
IZS venezie
Circuito Aqua IV IZS
Identificazione e
titolazione ceppi virali
5 ampolle contenenti
ceppi virali liofilizzati
2Centro di Referenza Nazionale –
IZS venezie
Circuito Aqua IB IZS
Identificazione batteri  patogeni per i pesci6 ampolle contenenti
ceppi batterici liofilizzati
3Centro di Referenza Nazionale –
IZS venezie
Circuito Aqua IZS 
Parassitologia molluschi
Identificazione di protozoi in preparati citologici ed istologiciPreparati istologici e citologici


Le principali caratteristiche dei diversi circuiti, distinte per laboratorio di appartenenza, sono descritte  di seguito :  

 

Laboratorio di patologia dei pesci (patologie di origine virale)

Il Centro di Referenza Nazionale per l’Ittiopatologia  organizza annualmente un circuito interlaboratorio in ambito virologico destinato agli Istituti Zooprofilattici che  eseguono prove di ittiovirologia. Il circuito viene organizzato dal CRN seguendo le stesse modalità adottate del centro di referenza comunitario nei circuiti proposti annualmente ai centri nazionali. Tale circuito prevede che i partecipanti eseguano l’isolamento, l’identificazione e la titolazione di cinque ceppi virali liofilizzati. I ceppi inviati nell’ambito del circuito sono ceppi di riferimento del CRN e consistono nei  principali agenti virali responsabili di malattia nelle specie ittiche, specialmente di quelle previste dal D.lgs 148/2008 che ha recepito la direttiva 2006/88/CE. Scopo del circuito è quello di verificare, per ogni laboratorio partecipante, l’efficienza nella identificazione degli agenti virali e valutare la sensibilità delle linee cellulari in uso nei diversi laboratori.
I dati raccolti nell’ambito del circuito vengono rielaborati al fine di preparare un report finale che viene inviato ai  singoli partecipanti. I risultati ottenuti vengono discussi durante un incontro organizzato dal DNR:

 

Laboratorio di patologia dei pesci ( patologie di origine batterica )

Per quanto riguarda le malattie batteriche, il CRN organizza annualmente un circuito internazionale a cui hanno partecipato, nel corso del 2009, 10 II.ZZ.SS. e 7 partner stranieri (Danimarca, Norvegia, Spagna, Slovacchia, Estonia, Olanda, Irlanda). Il ring trial consisteva nella identificazione di ceppi batterici patogeni per gli organismi acquatici, di referenza o di campo, liofilizzati ed anonimi. Il punteggio utilizzato per esprimere un giudizio sulle performances del laboratorio variava in base alla capacità di identificare correttamente genere e specie del microrganismo patogeno. I risultati del circuito interlaboratorio sono stata valutati verificando la concordanza (k di Cohen) tra i dati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti.

 

Laboratorio di patologia dei molluschi

Il Laboratorio di Riferimento Nazionale per la Patologia dei molluschi organizza annualmente un circuito interlaboratorio in ambito parassitologico destinato agli Istituti Zooprofilattici che  eseguono prove di patologia molluschi. Il circuito viene organizzato dal CRN seguendo le stesse modalità adottate del centro di referenza comunitario nei circuiti proposti annualmente ai centri nazionali. Tale circuito prevede che i partecipanti eseguano l’identificazione di alcuni protozoi patogeni, tramite lettura di preparati citologici ed istologici. I vetrini, inviati nell’ambito del circuito fanno parte del materiale di riferimento del CRN e consistono nei  principali agenti patogeni, segnatamente protozoi, responsabili di malattia in molluschi bivalvi allevati in Italia e previste dal D.Lgs 148/2008. Scopo del circuito è quello di verificare, per ogni laboratorio partecipante, l’efficienza degli operatori coinvolti nella identificazione degli agenti patogeni.
I dati raccolti nell’ambito del circuito vengono rielaborati al fine di preparare un report finale che viene inviato ai  singoli partecipanti. 
I risultati del circuito interlaboratorio sono stata valutati verificando la concordanza (k di Cohen) tra i dati ottenuti dai singoli laboratori partecipanti.





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