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Ministero della Salute
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Piano Nazionale Integrato 2011-2014

A cura di:
Direzione generale per l'igiene e la sicurezza degli alimenti e la nutrizione

Web editing:
M. DE MARTINO



Cap. 2B - LNR Campylobacter

Data di aggiornamento: 11 giugno 2014

LNR per Campylobacter
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise “G.Caporale”
Via Campo Boario, 64100 Teramo
www.izs.it

 

1) Elenco delle attività di analisi

Il Laboratorio Nazionale di Riferimento (LNR) per Campylobacter esegue accertamenti sulle seguenti matrici: alimenti destinati all’uomo, alimenti zootecnici, feci e campioni da animali, tamponi ambientali effettuati nell’area di preparazione o manipolazione degli alimenti.
Le prove vengono eseguite secondo metodi ufficiali, accreditate secondo la norma ISO 17025 (Tabella 1).

Tabella 1. Metodi utilizzati per la ricerca e numerazione di Campylobacter
MetodoRiferimento
Isolamento da matrici alimentariISO 10272-1:2006
Isolamento da matrici provenienti da animali (feci, organi, fluidi ecc.)Manuale OIE parte 2 Sezione 2.9 Capitolo 2.9.3 paragrafo B punto 1c, d, e - 6 Edizione 2008
Conta in piastra (numerazione) da matrici alimentariISO 10272-2:2006

Il Laboratorio di riferimento esegue prove di identificazione e caratterizzazione su ceppi di Campylobacter jejuni e Campylobacter coli isolati dal laboratorio o provenienti da laboratori Italiani (Tabella 2).

Tabella 2. Metodi utilizzati per identificazione e la caratterizzazione di ceppi di Campylobacter
MetodoRiferimento
Identificazione di Campylobacter mediante PCR multiplex

Wang G, Clark CG, Taylor TM, Pucknell C, Barton C, Price L, Woodward DL, Rodgers FG. Colony multiplex PCR assay for identification and differentiation of Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, and C. fetus subsp. fetus. J Clin Microbiol. 2002 Dec;40(12):4744-7.

Marshall SM, Melito PL, Woodward DL, Johnson WM, Rodgers FG, Mulvey MR. Rapid identification of Campylobacter, Arcobacter, and Helicobacter isolates by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the 16S rRNA gene. J Clin Microbiol. 1999 Dec;37(12):4158-60.

Sierotipizzazione di Campylobacter  jejuni mediante emoagglutinazione passivaPatton CM, Barrett TJ, Morris GK. Comparison of the Penner and Lior methods for serotyping Campylobacter spp. J Clin Microbiol. 1985 Oct;22(4):558-65.
Caratterizzazione di Campylobacter jejuni e Campylobacter coli mediante PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)

Pulsenet USA – The National Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance. CDC. One-Day (24-26 h) Standardized Laboratory Protocol for Molecular

Subtyping of Campylobacter jejuni by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE).

http://www.pulsenetinternational.org/protocols/Pages/default.aspx

Caratterizzazione dei ceppi di Campylobacter jejuni e Campylobacter coli mediante S-AFLP (single-enzyme amplified fragment length polymorphism)Champion OL, Best EL, Frost JA. Comparison of pulsed-field gel electrophoresis and amplified fragment length polymorphism techniques for investigating outbreaks of enteritis due to campylobacters. J Clin Microbiol. 2002 Jun;40(6):2263-5.
Determinazione del profilo di resistenza di Campylobacter spp. agli antimicrobici

CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). 2010. Performance Standard for Antimicrobial Susceptibility Testing; M100-S20 Vol. 30 No.1. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.

CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). 2010.Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria; Approved Guideline-Second Edition; M45-A Vol. 30 No.18. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.

Sequenziamento di geni di resistenza per chinoloni e fluorochinoloniZirnstein G, Li Y, Swaminathan B, Angulo F. Ciprofloxacin resistance in Campylobacter jejuni isolates: detection of gyrA resistance mutations by mismatch amplification mutation assay PCR and DNA sequence analysis. J Clin Microbiol. 1999 Oct;37(10):3276-80.
Tipizzazione molecolare di Campylobacter jejuni mediante MLST (Multilocus sequence typing)Dingle KE, Colles FM, Wareing DR, Ure R, Fox AJ, Bolton FE, Bootsma HJ, Willems RJ, Urwin R, Maiden MC. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 2001 Jan;39(1):14-23.
Tipizzazione molecolare di Campylobacter jejuni mediante sequenziamento della regione corta variabile del genoma della flagellina A (flaA-SVR sequencing)Nachamkin I, Bohachick K, Patton CM. Flagellin gene typing of Campylobacter jejuni by restriction fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol. 1993 Jun;31(6):1531-6. 
Tipizzazione molecolare di Campylobacter jejuni mediante Microarray

Maynard C, Berthiaume F, Lemarchand K, Harel J, Payment P, Bayardelle P, Masson L, Brousseau R. Waterborne pathogen detection by use of oligonucleotide-based microarrays.

Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8548-57.

Sequenziamento dell’intero genoma di Campylobacter jejuni (WGS)

Sheppard SK, Jolley KA, Maiden MCJ. A gene-by gene

approach to bacterial population genomics: whole genome

MLST of Campylobacter. Genes. 2012;3:261–277.

I metodi di identificazione dei ceppi con PCR multiplex, la sierotipizzazione di Campylobacter jejuni e la caratterizzazione tramite PFGE sono stati validati e accreditati.

 

2) Sistemi di gestione e controllo della qualità

Il Laboratorio applica un Sistema Qualità rispondente ai requisiti della norma ISO 17025 e ha  prove accreditate dal SINAL sin dal 1995.

I metodi di prova utilizzati e la competenza tecnica del personale sono sotto controllo sia tramite l’impiego di materiali di riferimento certificati  che con la partecipazione ai circuiti interlaboratorio.

I circuiti a cui il Laboratorio di Riferimento partecipa sono organizzati da enti privati riconosciuti a livello internazionale e dal Laboratorio Comunitario di Riferimento per Campylobacter (EU-RL Svezia).

Il LNR partecipa con continuità ai circuiti interlaboratorio per la ricerca e numerazione di Campylobacter da matrici alimentari organizzati dal QMS (Microbiology Scheme) (LGC, UK) e a quelli organizzati dall’EU-RL.

Le prove dei circuiti interlaboratorio organizzati dal Laboratorio Comunitario di Riferimento comprendono sia la ricerca di Campylobacter da tonsille cecali di pollo che la tipizzazione del microorganismo in PCR.

La competenza tecnica del personale che opera nel LNR  è garantita dalla partecipazione regolare alle attività di formazione e addestramento, contenute nel piano aziendale di formazione od organizzate all’esterno. Il personale partecipa, inoltre, alle attività  di formazione svolte dall’EU-RL.

 

3) Modalità di pianificazione e realizzazione delle prove interlaboratorio e di confronto

Il Laboratorio dal 2011 organizza specifici circuiti interlaboratorio con l’obiettivo di monitorare il livello di competenza tecnica dei laboratori ufficiali presenti su territorio nazionale.

I circuiti sono due, uno per la ricerca di Campylobacter da matrici animali e uno per la ricerca/numerazione di Campylobacter da matrici alimentari. Al primo circuito partecipano mediamente 18 laboratori e al secondo 22 laboratori. Dal 2014 sarà effettuato un terzo circuito per l’identificazione dei ceppi di Campylobacter isolati tramite metodi molecolari (PCR) .

Il Laboratorio partecipa a sua volta ai circuiti organizzati dall’EU-RL: uno sull’identificazione del Campylobacter con PCR e l’altro per la ricerca e numerazione di Campylobacter da matrici alimentari.





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