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Afta epizotica - IZS Lombardia, Emilia Romagna

FONTE: Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR)

LNR per l’Afta epizootica - Centro di referenza nazionale per l’afta epizootica e le malattie vescicolari
IZS Lombardia ed Emilia Romagna

Nel 2016 sono state realizzate le seguenti attività:

  1. Proficiency test per prove diagnostiche virologiche e sierologiche per Afta Epizootica destinate ai laboratori dell’Algeria
  2. Proficiency Test organizzato per 10 Paesi Balcanici come esercizio di simulazione di laboratorio finalizzato a valutare la capacità di risposta dei paesi ad una possibile incursione di afta epizootica
  3. Proficiency test (PT) internazionale, organizzato dal Community Reference Laboratory/World Reference Laboratory


Proficiency test per prove diagnostiche virologiche e sierologiche per Afta Epizootica destinate ai laboratori dell’Algeria

Twinning EU-Algeria «Mise à niveau des laboratoires de l’Institut national de la médecine vétérinaire aux standards européens et internationaux»

Matrici
Pannello A per prove virologiche: N. 10 campioni di cui sei contenenti virus aftosi inattivati appartenenti ai sierotipi O, A e SAT2 e quattro negativi, come dettagliato nella tabella seguente.

Proficiency Test Algeria: composizione del pannello A per l’esecuzione delle prove virologiche (Ag detection ELISA e PCR)

Descrizione campioneDiluizioneID CAMPIONERISULTATI ATTESI
FMDV O Manisa (Lotto 08/1)1/1004Positivo Tipo O
FMDV O Manisa (Lotto 08/1)1/5001, 5, 9Positivo Tipo O
FMDV A Iran 96 (Lotto 1/2003)1/1503Positivo Tipo A
FMDV SAT2 (Lotto 29/09/2010)1/106Positivo Tipo SAT2
Negativo//2, 7, 8, 10Negativo


Pannello B per prove sierologiche: N. 9 sieri bovini di campo prelevati in aree endemiche per Afta epizootica del Nord Africa dove si pratica la vaccinazione e N. 1 siero bovino di origine italiana (vedi tabella seguente). I sieri erano selezionati in modo da rappresentare diversi stati immunologici (negativo, infezione, vaccinazione) nei confronti dei tre sierotipi aftosi O, A, SAT2.

Proficiency Test Algeria: composizione del pannello B per l’esecuzione delle prove sierologiche (ELISA per la ricerca di Ac verso le proteine strutturali (SP) e non strutturali (NSP)

OrigineID CAMPIONEESITO ATTESO

Sieri bovini prelevati in regioni endemiche con vaccinazione

del Nord Africa

1Negativo
2Positivo SP O, A, SAT2 & Positivo NSP
3Positivo SP O, A, SAT2 & Positivo NSP
4Negativo
5Debole Positivo SP O, A, SAT2
6Positivo SP A, SAT2
7Positivo SP O
8Negativo
9Positivo SP O, A, SAT2 & Positivo NSP
Siero bovino italiano10Negativo


Analiti
Per le Prove virologiche:

  • Antigeni di virus aftosi, con dimostrazione e identificazione del sierotipo attraverso prova ELISA (kit IZSLER)
  • Genoma dei virus aftosi, attraverso RT-PCR realtime e convenzionale.


Per le Prove sierologiche:

  • Anticorpi anti-Proteine Non Strutturali (NSP) dei virus aftosi (test ELISA DIVA)
  • Anticorpi anti-Proteine Strutturali (SP) dei virus aftosi con sierotipizzazione (test ELISA per sierotipi O e A)

Luogo e periodo di svolgimento
Luogo: Algeria, tre Laboratori (vedi dettaglio punto successivo)
Periodo: febbraio-aprile 2016

Numero e tipo di laboratori partecipanti
N. 3 Laboratori Algerini: Laboratorio Nazionale di Algeri (LCVA), Laboratorio di Tlencem (LRVT), Laboratorio di Costantine (LRVC)

Follow up, Conclusioni e Raccomandazioni
La prova interlaboratorio è stata organizzata nell’ambito del twinning EU-Algeria «Mise à niveau des laboratoires de l’Institut national de la médecine vétérinaire aux standards européens et internationaux», al quale il CERVES/LNR per Afta  ha contribuito per la diagnostica dell’afta.

Il Proficiency test era indirizzato a valutare i progressi tecnici dei tre laboratori algerini rispetto alle metodiche oggetto del training. I risultati ottenuti dai tre laboratori partecipanti sono stati descritti per esteso in un Report finale che includeva le raccomandazioni suggerite dagli esperti del CERVES/LNR per Afta al fine di migliorare ulteriormente le perfomance diagnostiche dei laboratori. Si riporta una sintesi per ciascun laboratorio.

Laboratorio di Algeri:
Il laboratorio ha eseguito correttamente le prove virologiche tramite ELISA e le prove sierologiche per la ricerca di anticorpi verso le proteine strutturali dei sierotipi aftosi A e O e verso le proteine non strutturali, marker di infezione, utilizzando i kit prodotti da IZSLER. Ha dimostrato di utilizzare correttamente i fogli di calcolo per l’elaborazione del dato finalizzata alla definizione del risultato finale.

LCVA ha dimostrato di saper eseguire correttamente le metodiche molecolari, tuttavia maggiore attenzione deve essere posta per evitare contaminazione durante le fasi di manipolazione dei campioni biologici e dell’RNA. E’ stato consigliato di ricalibrare il controllo positivo delle reazioni Real-Time e di stabilire, per quanto possibile, criteri di accettabilità dei dati e valori di cut-off che permettano una maggiore standardizzazione dei risultati ottenuti.  

Rispetto alla valutazione sull’organizzazione, il laboratorio di Algeri risulta ben organizzato, sia da un punto di vista logistico che rispetto al sistema qualità.

Laboratorio di Tlemcen:
Il laboratorio ha eseguito correttamente le prove sierologiche e virologiche tramite ELISA utilizzando i kit prodotti da IZSLER. E’ stato comunque raccomandato di seguire i protocolli previsti per l’esecuzione delle prove e di elaborare i dati grezzi ottenuti al termine delle reazioni per ottenere dati idonei per l’interpretazione finale. LRVT ha dimostrato di saper eseguire correttamente le metodiche molecolari, anche se si è evidenziata ancora un pò di incertezza nell’esecuzione dei metodi che si potrebbe superare con una maggior pratica. E’ stato consigliato di ricalibrare il controllo positivo delle reazioni Real-Time e di stabilire, per quanto possibile, valori di cut-off che permettano una maggiore standardizzazione dei risultati ottenuti.

Rispetto alla valutazione sull’organizzazione, il Laboratorio di Tlemcen ha mostrato nell’ultimo anno del twinning un significativo miglioramento.

Laboratorio di Constantine:
Il Laboratorio ha eseguito solamente le prove per la ricerca di anticorpi verso le proteine non strutturali e verso le proteine strutturali dei sierotipi aftosi O e A, utilizzando kit ELISA di tipo della ditta ID-Vet; i risultati sono stati espressi solo in termini qualitativi (positivo/negativo), poiché i sieri sono stati esaminati in singola diluizione, come previsto dal kit e non in diluizione, procedura che consente di calcolare il titolo anticorpale. Gli esiti delle prove sono stati conformi all’atteso, ad eccezione di un falso-positivo per anticorpi verso il sierotipo A. Sebbene il laboratorio abbia registrato un esito non conforme, le performance del laboratorio si ritengono adeguate, visto anche il mancato coinvolgimento del laboratorio a tutte le fasi di formazione previste dal twinning.

Osservazione generale: E’ stato fatto osservare che i laboratori sarebbero facilitati nella esecuzione e nell’interpretazione dei risultati dei test nonché nella loro standardizzazione, se non dovessero in continuazione cambiare i kit utilizzati. L’acquisto dei reagenti utilizzati nei test di laboratorio dovrebbe essere razionalizzato e concordato con il laboratorio.


Proficiency Test organizzato per 10 Paesi Balcanici come esercizio di simulazione di laboratorio finalizzato a valutare la capacità di risposta dei paesi ad una possibile incursione di afta epizootica

Matrici
Pannello A per prove virologiche: N. 6 omogenati di epitelio negativi o artificialmente infettati con varie dosi di virus aftoso tipo A inattivato
Pannello B per prove sierologiche: N. 10 sieri bovini e ovini, negativi e positivi con diversi tipi e livelli di anticorpi anti-aftosi.

Analiti
Per le Prove virologiche:

  • Antigeni di virus aftosi, con dimostrazione e identificazione del sierotipo attraverso prova ELISA (kit IZSLER)
  • Genoma dei virus aftosi, attraverso RT-PCR realtime.

Per le Prove sierologiche:

  • Anticorpi anti-Proteine Non Strutturali (NSP) dei virus aftosi (test ELISA DIVA, kit commerciale)
  • Anticorpi anti-Proteine Strutturali (SP) dei virus aftosi (test ELISA per sierotipi O, A, Asia 1 con kit IZSLER)

Luogo e periodo di svolgimento
Luogo: 10 Paesi della regione balcanica: Montenegro, Bosnia Erzegovina, Macedonia, Moldavia, Albania, Kosovo, Romania, Grecia, Bulgaria, Croazia
Periodo: aprile-giugno 2016

Numero e tipo di laboratori partecipanti
N. 10 laboratori Nazionali di Referenza dei Paesi: Montenegro, Bosnia Erzegovina, Macedonia, Moldavia, Albania, Kosovo, Romania, Grecia, Bulgaria, Croazia.

Follow up, Conclusioni e Raccomandazioni
Il secondo FMD Proficiency Test è stato organizzato per 10 Paesi Balcanici come esercizio di simulazione di laboratorio finalizzato a valutare la capacità di risposta dei paesi ad una possibile incursione. In particolare sono state valutate:

  1. la capacità di importare e ricevere a destinazione con rapidità materiali e reagenti diagnostici
  2. la capacità di generare rapidamente risultati di laboratorio accurati
  3. la capacità di interpretare i risultati nel contesto dello scenario epidemiologico.

L’attività ha comportato l’ideazione di uno scenario, la preparazione e spedizione di pannelli di campioni da sottoporre alle prove diagnostiche, la raccolta e verifica dei risultati, la stesura di un report esaustivo, una serie di teleconferenze con ciascuno dei paesi partecipanti per discutere singolarmente risultati e criticità.

Conclusioni:

  1. Tutti i laboratori sono risultati in grado di eseguire correttamente i test ELISA, in particolare:
    • kit ELISA for anti-SP Ab detection (serotypes O, A, Asia1) e anti-NSP Ab detection
    • kit ELISA for FMDV Ag Detection and serotyping
  2. Nove laboratori erano attrezzati con strumentazione per l’esecuzione di test Realtime RT-PCR, tra questi:
    • Sette hanno fornito i risultati del test real-time RT-PCR
    • Cinque laboratori hanno prodotto risultati accurati
  3.   Velocità nella produzione dei risultati:
    • Le analisi e il report dei risultati di sei Paesi sono stati ottenuti in tre giorni
    • Altri quattro paesi hanno avuto ritardi nell’esecuzione dei test e reporting dei risultati dovuti a varie cause, dalla capacità di ritirare e processare campioni e kit in aeroporto, alla contemporanea emergenza per LSD.
  4. Il disegno di questo Esercizio di simulazione di una emergenza di laboratorio, basato su uno scenario “real-life”, ha evidenziato buona capacità diagnostica dei laboratori e robustezza dei kit ELISA, ma è stata riscontrata una debolezza nella capacità di interpretare correttamente i risultati, in particolare i risultati sierologici data l’esistenza di cross-reazioni tra sierotipi, in relazione allo scenario epidemiologico.

Come follow-up è stato suggerito di organizzare nel prossimo futuro workshop/seminari online per la risoluzione di criticità rilevate, ad esempio sull’interpretazione dei risultati di prove multiple in riferimento a diversi scenari epidemiologici, e training ad hoc per l’implementazione della PCR nei pochi paesi non attrezzati per il test.


Matrici
Pannello 1: Outbreak scenarios of vesicular diseases (FMD and/or SVD)
N. 4 campioni di omogenato epitelio vescicolare bovino, N. 2 campioni di omogenato epitelio vescicolare suino, potenzialmente contenenti virus infettanti per test di isolamento in colture cellulari e caratterizzazione tramite sequenziazione

Pannello 2: Quality Assurance FMDV samples to ensure recent strains are detected.
N. 4 campioni bovini, simulazione di omogenato di epitelio vescicolare, negativi o contaminati con virus afta/MVS, per test ELISA e PCR finalizzati alla dimostrazione di antigeni e genoma virali di virus aftosi e MVS.

Pannello 3: Serological samples from an outbreak scenario in panel 1.
N. 6 sieri bovini per prove sierologiche afta (ELISA-SP, ELISA-NSP, Sieroneutralizzazione, vari sierotipi)

Pannello 4: Serological samples from an outbreak scenario in panel 1.
N. 3 sieri suini per prove sierologiche MVS (ELISA screening, ELISA IgG/IgM, Sieroneutralizzazione).

Analiti
Pannello 1: virus infettanti afta e MVS
Pannello 2: antigeni e genoma virus aftosi e MVS
Pannello 3: anticorpi anti-SP e anti-NSP dei virus aftosi
Pannello 4: anticorpi anti-MVS

Luogo e periodo di svolgimento
Luogo: presso il CERVES/LNR afta e MVS, IZSLER Brescia, Laboratori BSL3+.
Periodo di esecuzione delle prove: Novembre 2016.

Numero e tipo di laboratori partecipanti

Laboratori Nazionali di referenza di tutti gli stati membri EU, oltre a numerosi Laboratori Nazionali di referenza di Paesi extra-CEE.

Ogni anno il CERVES/LNR per afta partecipa al proficiency test (PT) internazionale, organizzato dal Community Reference Laboratory/World Reference Laboratory.

I PT annuali sono organizzati congiuntamente per AFTA e MVS, comportano l’analisi di campioni, differenziati in pannelli per prove virologiche e sierologiche, con una serie di test e richiedono una diagnosi differenziale con interpretazione finale sul risultato per ciascun test individualmente e nel loro insieme. Quindi, questa tipologia di proficiency tests verifica sia le performance del laboratorio relativamente a singoli test utilizzati, sia la capacità di interpretare correttamente i risultati ottenuti nella complessità delle situazioni simulate (diagnosi differenziale e nel caso di afta vaccinazione e/o infezione con quale sierotipo).

Il CERVES/LNR è sempre stato tra i pochi laboratori europei in grado di dare risposta a tutte le prove del ring test ottenendo esiti conformi, con sensibilità adeguata, in tutte le prove. Infatti, anche i risultati ottenuti dal CERVES nel proficiency test 2015, resi disponibili durante il 2016, sono stati corretti sia nella produzione del dato analitico che nell’interpretazione.

Nel 2016 lo scopo del PT, oltre alla abituale verifica delle performance delle varie prove diagnostiche finalizzata al mantenimento dei requisiti di Qualità, includeva l’interpretazione dei risultati sulla base di scenari definiti, con la richiesta di descrivere il flusso diagnostico per la rapida conferma di focolai di Afta/MVS, inclusa per la prima volta la caratterizzazione/identificazione del ceppo virale tramite sequenziazione, e per una sorveglianza post-focolaio, utilizzando una appropriata selezione di test diagnostici.

E’ consuetudine degli organizzatori del PTS comunicare gli esiti l’anno successivo a quello di esecuzione delle prove. Pertanto, gli esiti del PTS 2016 saranno resi disponibili nel 2017 (mese di maggio). Questa modalità organizzativa non consente di commentare le risultanze del ring test eseguito nell’anno.

Il ring test per l’anno 2016 è pervenuto al CERVES nell’ultimo trimestre, pertanto come di consueto l’esito del ring test sarà comunicato nell’anno successivo (2017).


Data di pubblicazione: 30 giugno 2017

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