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Biotossine Marine - Laboratorio Nazionale di Riferimento

FONTE: Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR)

Laboratorio Nazionale di Riferimento per le biotossine marine
Fondazione Centro Ricerche Marine

La Fondazione Centro Ricerche Marine, Laboratorio Nazionale di Riferimento per le Biotossine Marine, nel 2015 ha organizzato le seguenti prove inter-laboratorio:

  1. Biotossine marine idrosolubili del tipo Paralytic Shellfish Poisoning (PSP)
    • 1 circuito interlaboratorio per le tossine PSP con il metodo biologico, metodo di riferimento, con la distribuzione a 10 laboratori (compreso il LNR) di n° 2 campioni di omogenato di molluschi così denominati: CRM/P/15/01 e CRM/P/15/02;
    • 1  circuito interlaboratorio per le tossine PSP con il metodo chimico in cromatografia liquida ad alta prestazione accoppiata alla fluorescenza (HPLC-FL), metodo alternativo, con la distribuzione a 3 laboratori (compreso il LNR) di n° 3 campioni di omogenato di molluschi, così denominati: CRM/P/15/03, CRM/P/15/04 e CRM/P/15/05.
  2. Biotossine marine idrosolubili del tipo Amnesic Shellfish Poisoning (ASP)
    • 1  circuito interlaboratorio per le tossine ASP con il metodo chimico in cromatografia liquida ad alta prestazione accoppiata alla rivelazione UV visibile (HPLC-UV), metodo di riferimento, con la distribuzione a 10 laboratori (compreso il LNR) di n° 2 campioni di omogenato di molluschi, così denominati: CRM/A/15/01 e CRM/A/15/02;
  3. Biotossine marine liposolubili
    • 1 circuito interlaboratorio con il metodo chimico in cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS), metodo di riferimento, con la distribuzione a 10 laboratori (compreso il LNR) di n° 2 campioni di omogenato di molluschi, così denominati CRM/L/15/01 e CRM/L/15/02.

Nel mese di settembre i campioni sono stati distribuiti ai Laboratori Ufficiali che hanno restituito i risultati ottenuti entro la data di scadenza richiesta e comunque non oltre il 27 novembre 2015.

I risultati, una volta elaborati, sono stati illustrati e discussi nell’ambito dell’incontro annuale dei Laboratori Ufficiali ed inviati successivamente a ciascun Laboratorio partecipante in formato di Report.

L’esito dei circuiti inter-laboratorio  è da ritenersi globalmente soddisfacente.

Si segnala tuttavia che:

  • 1 Laboratorio ha conseguito risultati di z-score “non conformi” per le biotossine idrosolubili ASP, 
  • e 2 Laboratori hanno conseguito risultati di z-score “non conformi” per le biotossine liposolubili.

Uno di questi 2 laboratori ha subito individuato che era stato commesso un errore di calcolo;

Per il secondo laboratorio sono state messe in atto le seguenti azioni:

  • contattata la persona di riferimento;
  • distribuito materiale supplementare per la ripetizione dell’analisi;
  • elaborati i nuovi risultati di cui è stata verificata la Conformità.


Biotossine marine idrosolubili del tipo Paralytic Shellfish Poisoning (PSP)
Tab. 1

Partecipanti

Hanno partecipato all’esercizio di intercalibrazione i  seguenti 11 Laboratori Ufficiali ciascuno dei quali è stato identificato con un numero di codice,  ai fini dell’anonimato.

FCRM, Laboratorio Nazionale di Riferimento per le Biotossine Marine, Cesenatico
IZS dell’Abruzzo e del Molise, Reparto Biologia Acque Marine e Pesca, Termoli
IZS dell’Abruzzo e del Molise, Reparto di Bromatologia e Residui, Teramo
IZS del Lazio e della Toscana, DO Alimenti, Laboratorio Gestione e Sicurezza dei Molluschi, Roma
IZS della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Sezione di Ferrara
IZS del Mezzogiorno, Dipartimento di Chimica, Portici
IZS del Piemonte Liguria e Valle d’Aosta, Laboratorio Chimico Liguria, Sezione di Genova
IZS della Sardegna, Ispezione degli Alimenti, Sassari
IZS della Sicilia, Laboratorio Alimenti Ittici, Area Microbiologia degli Alimenti, Palermo
IZS Umbria Marche, Laboratorio Controllo Chimico e Biomonitoraggio, Ancona
IZS delle Venezie, SC1 Microbiologia Alimentare, Legnaro

Tab. 2

Risultati

I risultati ottenuti sono riassunti nelle Tabelle 1, 2, 3 e 4 e nella Figura 1.

  • 10 Laboratori hanno applicato il metodo di riferimento AOAC 959.08 (saggio biologico - MBA);
  • 2 di questi hanno applicato anche il metodo chimico AOAC 2005.06 (metodo HPLC-FLD);
  • 1 Laboratorio ha applicato, oltre al metodo biologico e al metodo chimico in HPLC-FLD, anche un metodo chimico in LC-MS/MS;
  • 1 Laboratorio ha utilizzato soltanto il metodo chimico HPLC-FLD


Risultati del Saggio Biologico

Tutti i partecipanti hanno fornito i tempi di sopravvivenza dei singoli topi utilizzati; soltanto uno (1515) ha calcolato le concentrazioni di STX diHCl eq./kg p.e. impiegando il C.F. in uso nel proprio laboratorio.

Nelle Tabelle 1 e 2  sono riportati i risultati dei campioni CRM/15/P/01 e CRM/15/P/02  ottenuti applicando il Metodo AOAC 959.08.

Campione CRM/15/P/01

Tutti i Laboratori partecipanti hanno assegnato al campione  il valore “tossina non determinabile”, risultato “Conforme” per tutti i partecipanti, trattandosi di mitili non contaminati da tossine PSP .

Tab.1 - Campione CRM/15/P/01. Giudizi attribuiti per la valutazione delle prestazioni per la determinazione delle tossine PSP nei molluschi bivalvi con il metodo biologico.
Tab. 3
C = Conforme

Campione CRM/15/P/02

I Laboratori hanno osservato la morte di tutti i topi iniettati, dando così un risultato di “tossina determinabile”. L’esito ottenuto è risultato in linea con quello atteso per cui è stato assegnato, a tutti i Laboratori, un giudizio di conformità.

Tab.2 - Campione CRM/15/P/02. Giudizi attribuiti per la valutazione delle prestazioni per la determinazione delle tossine PSP nei molluschi bivalvi con il metodo biologico.
Tab. 4
C = Conforme

Risultati dell’Analisi Chimica

I Laboratori 1504, 1513 e 1515 hanno eseguito sui materiali di prova l’analisi chimica per la determinazione delle tossine PSP utilizzando il metodo AOAC 2005.06. Il laboratorio 1513 ha utilizzato anche un metodo interno in LC-MS/MS.

Nella seguente tabella sono riportati i risultati, corretti per il recupero, della tossicità totale nei campioni CRM/15/P/03 e CRM/15/P/04 valutati come unico set di dati, trattandosi dello stesso materiale distribuito.
Tab. 5

Inoltre in Fig.1 è riportata la rappresentazione grafica degli z’-score ottenuti
Fig. 1

I risultati del campione CRM/15/P/05 sono riportati nella Tabella seguente (Tab.4).

Tab.4 - Risultati della TOSSICITÀ TOTALE rilevata dai Laboratori partecipanti con il metodo chimico. Campione CRM/15/P/05
Tab. 5

I tre Laboratori partecipanti, seppur con espressioni differenti del risultato, hanno correttamente rilevato che il campione CRM/15/P/05 non conteneva tossine appartenenti al gruppo PSP.

Conclusioni

Per quanto riguarda i laboratori che utilizzano il metodo biologico AOAC OMA 959.08 è stata osservata una migliore performance rispetto alle prove degli anni precedenti. Infatti:

  • per il campione CRM/15/P/01, costituito da omogenato di mitili non contaminati da tossine PSP - tutti i Laboratori, in modo concorde, non hanno rilevato presenza di tossine. L’esito è da ritenersi SODDISFACENTE.
  • per il campione CRM/15/P/02, costituito da omogenato di mitili naturalmente contaminati per tossine del tipo PSP - tutti i Laboratori, in modo concorde, hanno rilevato presenza di tossicità (tossine PSP determinabili). L’esito è da ritenersi SODDISFACENTE.

Per quanto riguarda i Laboratori che hanno applicato i metodi chimici, tutti hanno correttamente individuato le tossine quantificabili presenti nel materiale distribuito e tutti hanno correttamente quantificato la tossicità totale. Infatti:

  • per i campioni CRM/15/P/03CRM/15/P/04 costituiti dallo stesso omogenato di mitili naturalmente contaminati tutti i Laboratori in modo concorde hanno rilevato concentrazioni da 930 a 1.417 µg STX diHCl eq./kg p.e. (superiori al limite di legge). L’esito è da ritenersi SODDISFACENTE.
  • per il campione CRM/15/P/05, costituito da omogenato di mitili non contaminati da tossine PSP - tutti i Laboratori, in modo concorde, non hanno rilevato presenza di tossicità. L’esito è da ritenersi SODDISFACENTE.


Biotossine marine idrosolubili del tipo Amnesic Shellfish Poisoning (ASP)
Tab 1

Partecipanti

Hanno partecipato alla prova valutativa per le determinazione delle tossine ASP nei molluschi bivalvi i seguenti 10 Laboratori Ufficiali, ciascuno identificato con un numero di codice,  ai fini dell’anonimato.

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise, Reparto Biologia Acque Marine e Pesca, Termoli (CB);
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e della Toscana, Direzione Operativa Chimica, Roma;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Reparto chimico degli alimenti, Bologna;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Dipartimento di chimica, Portici (NA);
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte Liguria e Valle d’Aosta, Laboratorio Chimico Liguria, Sezione di Genova;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Bromatologia, Sassari;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Laboratorio di Tossicologia, Area Chimica e Tecnologie Alimentari, Palermo;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria Marche, Laboratorio Controllo Chimico e Biomonitoraggio, Ancona;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Chimico, Legnaro (PD);
Fondazione Centro Ricerche Marine, Laboratorio Nazionale di Riferimento per le Biotossine Marine, Cesenatico (FC).

Risultati

Per la prova valutativa per tossine ASP, sono stati preparati e distribuiti a 10 Laboratori Ufficiali N. 2 campioni: CRM/15/A/01 e CRM/15/A/02 contaminati da tossine ASP. Il campione CRM/15/A/01 era costituito da omogenato di cappesante (Pecten maximus), mentre il campione CRM/15/A/02 era costituito da omogenato di mitili irlandesi (Mytilus spp.).

Campione CRM/15/A/01

I 10 Laboratori hanno assegnato al campione CRM/15/A/01 un valore compreso tra 30,60 e 52,96 mg(DA+epiDA)/kg di parte edibile. Tutti i laboratori partecipanti hanno perciò determinato una concentrazione di tossine ASP superiore al limite di legge (20 mg/kg).

Nella figura seguente (Fig.1) viene riportata la rappresentazione grafica degli z’-score ottenuti.
Fig. 1
Fig.1 – z’-scores ottenuti dai laboratori partecipanti alla prova valutativa per la determinazione delle tossine ASP nel campione CRM/15/A/01.

Campione CRM/15/A/02

I 10 Laboratori hanno assegnato al campione CRM/15/A/02 un valore compreso tra 2,65 e 4,85 mg(DA+epiDA)/kg di parte edibile. Tutti i laboratori partecipanti hanno perciò determinato una concentrazione di tossine ASP inferiore al limite di legge (20 mg/kg).

Nella seguente figura (Fig.2) viene riportata la rappresentazione grafica degli z’-score ottenuti.
Fig. 2
Fig.2 – z’-scores ottenuti dai laboratori partecipanti alla prova valutativa per la determinazione delle tossine ASP nel campione CRM/15/A/02.

Conclusioni

L’esito della prova valutativa per tossine ASP è da ritenersi globalmente soddisfacente (10% di risultati non accettabili sul totale dei valori restituiti). Infatti:

  • per il campione CRM/15/A/01, con valore assegnato di 44,27±4,00 mg(DA+epiDA)/kg p.e.. - tutti i laboratori hanno restituito dati SODDISFACENTI, tranne il laboratorio 1502 che ha ottenuto un risultato NON SODDISFACENTE;
  • per il campione CRM/15/A/02, con valore assegnato di 4,49±0,57 mg(DA+epiDA)/kg p.e.. - tutti i laboratori che hanno restituito dati quantitativi sono stati SODDISFACENTI, tranne il laboratorio 1502.

Per questo Laboratorio la Fondazione Centro Ricerche Marine ha inviato materiale supplementare e si è resa disponibile per attività di formazione e supporto tecnico.

 


Biotossine marine liposolubili

Tab 1

Partecipanti

Hanno partecipato all’esercizio di intercalibrazione i seguenti 11 Laboratori Ufficiali, ciascuno  identificato con un numero di codice,  ai fini dell’anonimato:

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise, Reparto di Bromatologia e  Residui, Teramo
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e della Toscana, Direzione Operativa Chimica, Roma;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Reparto chimico degli alimenti, Bologna;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Dipartimento di chimica, Portici (NA);
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte Liguria e Valle d’Aosta, Laboratorio Chimico Liguria, Sezione di Genova;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Laboratorio Ispezione degli Alimenti, Sassari;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Bromatologia, Sassari;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Laboratorio di Tossicologia, Area Chimica e Tecnologie Alimentari, Palermo;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria Marche, Laboratorio Controllo Chimico e Biomonitoraggio, Ancona;
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Chimico, Legnaro (PD);
Fondazione Centro Ricerche Marine, Laboratorio Nazionale di Riferimento per le Biotossine Marine, Cesenatico (FC).

Materiali di prova e Metodi utilizzati

Per questo esercizio di intercalibrazione sono stati preparati e distribuiti 2 campioni: il campione CRM/15/L/01, costituito da omogenato di mitili (Mytilus galloprovincialis) naturalmente contaminati da yessotossine, ed il campione CRM/15/L/02, costituito da omogenato di mitili (Mytilus galloprovincialis) naturalmente contaminati da acido okadaico e pectenotossine.

Ai Laboratori è stato richiesto di utilizzare il metodo chimico “EU-Harmonised Standard Operating Procedure for detection of lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC-MS/MS, Version 5, January 2015”, metodo di riferimento per l’analisi delle tossine liposolubili come definito dal Reg. (UE) N. 15/2011.

Il Laboratorio 1514, che non applica il metodo chimico, ha partecipato all’esercizio utilizzando il metodo immuno-enzimatico.

Risultati

Campione CRM/15/L/01

I 10 laboratori che hanno applicato il metodo chimico, hanno correttamente determinato una concentrazione di yessotossine totali superiore al limite di legge (3,75 mg YTXeq./kg), ma con valori compresi tra 4,03 e 16,21 mg YTXeq./kg di parte edibile. Tutti questi Laboratori hanno individuato la presenza di YTX, hYTX, 45-OH YTX e 45-OH hYTX.

Nella figura seguente sono rappresentati graficamente i valori di z’-score ottenuti per le yessotossine totali.
fig 1
Fig. 1 – z’-scores ottenuti dai laboratori partecipanti alla prova valutativa per la determinazione

di yessotossine totali (YTXs) nel campione CRM/15/L/01.

Da rilevare che il Laboratorio 1514, che non applica il metodo chimico, non ha restituito risultati per questo campione.

Campione CRM/15/L/02

La figura 2 riporta i valori di z’-score ottenuti dall’elaborazione dei risultati di okaidati totali rilevate nel campione da tutti gli 11 Laboratori partecipanti.

Soltanto 7 Laboratori hanno rilevato la presenza di pectenotossine nel campione (Fig.3).
fig 3
Fig. 2 – z’-scores ottenuti dai laboratori partecipanti alla prova valutativa per la determinazione

di Total OA group nel campione CRM/15/L/02.
fig 3
Fig. 3 – z’-scores ottenuti dai laboratori partecipanti alla prova valutativa per la determinazione

Conclusioni

L’esito della prova valutativa per Tossine Liposolubili è da ritenersi globalmente soddisfacente.

In particolare:

  • per il campione CRM/15/L/01, costituito da omogenato di mitili naturalmente contaminati da yessotossine - tutti i laboratori hanno restituito dati SODDISFACENTI, tranne i laboratori 1502 e 1507; il laboratorio 1513  ha ottenuto risultati QUESTIONABILI.
  • per il campione CRM/15/L/02,costituito da omogenato di mitili naturalmente contaminati da acido okadaico e pectenotossine -  tutti i laboratori che hanno restituito dati quantitativi sono stati valutati come SODDISFACENTI, tranne i laboratori 1502 e 1507.

Follow-upper i 2 Laboratori (1502 e 1507) che hanno ottenuto risultati Non Soddisfacenti:

  • al Laboratorio 1507 che ha subito individuato di aver commesso un errore di calcolo, non è stato necessario richiedere la ripetizione delle prove;
  • per il Laboratorio 1507 invece, è stata contattata la persona di riferimento, distribuito materiale supplementare per la ripetizione dell’analisi ed elaborati i nuovi risultati di cui è stata verificata la Conformità.


Data di pubblicazione: 30 giugno 2016

Tag associati a questa pagina: Pesci, molluschi e crostaceiSicurezza alimentare


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